引物序列验证Word文件下载.docx

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3.点击“BLAST！

”，新页面完全出来以后，点击“Format！

”。

4.结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。

当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'

端正好和上游引物序列的3'

端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。

如果有，那你的引物序列就是正确的。

从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析分析到底引物好不好。

实例

1、进入网页：

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

2、点击Searchforshort,nearlyexactmatches

3、在search栏中输入引物系列：

注：

文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

（1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。

这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。

（2）简便的做法是同时输入上下游引物：

有以下两种方法。

输入上下游引物系列都从5’——3’。

A、输入上游引物空格输入下游引物

B、输入上游引物回车输入下游引物

4、在optionsforadvancedblasting中：

selectfrom栏通过菜单选择Homosapiens【ORGN】

Expect后面的数字改为10

5、在format中：

Expect后面的数字填上010

6、点击网页中最下面的“BLAST!

”

7、出现新的网页，点击Format!

8、等待若干秒之后，出现resultsofBLAST的网页。

该网页用三种形式来显示blast的结果。

（1）图形格式：

图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分

图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补

图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配

通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。

（2）结果信息概要：

从左到右分别为：

A、数据库系列的身份证：

点击之后可以获得该序列的信息

B、系列的简单描述

C、高比值片段对（high-scoringsegmentpairs,HSP）的字符得分。

按照得分的高低由大到小排列。

得分的计算公式=匹配的碱基×

2+0.1。

举例：

如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。

D、E值：

代表被比对的两个序列不相关的可能性。

【TheEvaluedecreasesexponentiallyastheScore（S）thatisassignedtoamatchbetweentwosequencesincreases】。

E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。

设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了

E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：

U代表：

Unigene数据库

E代表：

GEOprofiles数据库

G代表：

Gene数据库

（3）结果详细信息：

①圈出来的部分代表序列的信息

②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：

共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×

2+0.1=42.1】，E值为0.020

上游引物与序列的2143～2163位点匹配

③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：

共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×

2+0.1=40.1】，E值为0.077。

下游引物与该序列的29360～29379位点互补

注意点：

①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢?

这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。

同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。

通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。

②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?

A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段

B、为该基因的DNA系列

C、为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。

结果判断：

①验证文献报道的引物是否正确：

如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。

如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用

②检测该引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反应的非特异扩增。

如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分数非常高。

这种结果表明所设计的引物序列特异性不高，最好重新设计引物，否则会得到非特异扩增的PCR产物。

如何验证设计引物序列是否合适？

zz合集

（2012-08-1011:

09:

38）

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标签：

杂谈

1.检验引物的特异性

Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-BLAST可以直接从Blast主页（http:

//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：

//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–animportantfeatureforPCRprotocolsmeasuringtissuespecificexpression（注：

没办法准确的翻译，只好作罢，汗！

）。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。

Primer-BLAST的输入

Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：

targettemplate（模板区）,theprimers（引物区）,和specificitycheck（特异性验证区）。

跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。

模板（Template）

在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificitycheck区选择）是唯一的。

引物（Primers）

如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物。

并且选择好验证的目标数据库（在specificitycheck区选择）。

根据需要可设置产物的大小，Tm值等。

特异性（Specificity）

在specificitycheck区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。

这一步是比较重要的。

这里提供了4种数据库：

RefSeqmRNA,Genome（selectedreferenceassemblies）,Genome（allchromosomes）,andnr（thestandardnon-redundantdatabase）。

前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。

特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

selectedreferenceassemblies包括以下的物种：

human,chimpanzee,mouse,rat,cow,dog,chicken,zebrafish,fruitfly,honeybee,Arabidopsis,和rice。

Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。

2.验证引物自身的特性

建议oligo6和primer5结合使用

在primer5.0里面，把你的基因序列粘上，在弹出窗口上选primer，点左上s是选正义，点editprimer,把你的正义引物序列粘上，点primer,就能找到你的引物在整个序列上的位置，如上再点a找反义的位置，找好后弹出窗口中rating代表评分，下面的几栏，分别是发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，found如为红色就是有这些东西，你看一下严不严重，尤其不能出现在3'

端，△G的绝对值越小越好。