分子生物学实验讲义Word格式.docx

分子生物学实验讲义Word格式.docx

《分子生物学实验讲义Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验讲义Word格式.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

NaOH~20g

AdjusttopH8.0

dH2Oto1000ml

组份浓度0.5MEDTA 

配制量1L 

配置方法 

1.称取186.1gNa2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。

2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3.用NaOH调节pH值值8.0（约20gNaOH）。

注意：

pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

4.加去离子水将溶液定容至1L。

5.适量分成小份后，高温高压灭菌。

6.室温保存。

3.1MTRIS-HCl

4.质粒提取溶液

溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；

溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；

溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml）

5.培养液/基

二、灭菌

手提式压力蒸汽灭菌器操作规范

1、堆放

将待灭菌的物品予以包扎好，然后顺序的放在灭菌桶内的筛板上，包与包之间应留有适当的空隙，以利于灭菌桶内的空气溢出和蒸汽的穿透，提高灭菌效果。

2、加水、

在灭菌器主体内加4升清洁水，水在灭菌过程中会逐渐蒸发，水面会相应降低。

因此，每次灭菌使用前，应向灭菌器主体内补充水量，以免热管脱水干烧，损坏电热管。

密封

3、密封

将灭菌桶放入灭菌主体内，把器盖上的软管扎入灭菌桶内壁上的半圆槽内，合上器盖。

并将器盖上螺栓槽对齐，然后顺序地将相对方位的翼行螺母嵌入槽内予以均匀地旋紧，使器盖与主体密合。

4、加热

将灭菌器电源插头插入10A220V外电源插座。

然后再将放气阀扳手拨到“放汽”位置，（图二）待有较急的蒸汽喷出时，即将放气阀的扳手拨着“关闭”位置，此时压力表指针朝顺时针方向缓慢转动，显示灭菌锅内压力正缓慢上升，同时温度随之升高。

5、灭菌

当灭菌器内压力到达所需范围时，用户可自行开始计算灭菌时间，按不同物品及包装，参照（表一）来确定灭菌所需要时间。

在灭菌过程中，用户可接上一只调压变压器，适当调低电压，使灭菌器内电压处于稳定状态。

但是，维持灭菌器内部恒压的压力不能低于用户选定值。

如果用户不选定上述控制热源的办法。

那么在灭菌过程中安全阀会间断的向外释放超压蒸汽，此时灭菌器内部的整定压力为0.165Ｍpa

６、干燥

对医疗器械、敷料和器具等在灭菌结束后需迅速干燥的物品。

可在灭菌结束后，将灭菌器的蒸汽通过放汽阀迅速排出　，待压力表指针恢复至“０”刻度，再稍等１－２分钟将器盖打开。

打开器盖后，再继续加热１０－１５分钟，使物品上残留水蒸汽蒸发掉。

切断电源，停止加热。

７、冷却

对培养基等液体之类的灭菌物品在灭菌结束后，切勿将灭菌器内蒸汽通过放器阀迅速排出，以免液体剧烈蒸腾而造成溢出或瓶子破裂等危险事故。

因此该类灭菌物品在灭菌结束后，应切断电源，停止加热。

待其冷却，直至压力表指针恢复“０”刻度，稍等数分钟后在将放气阀　

三、实验仪器的使用

1.PCR仪的使用

（略）

2.凝胶成像系统的使用

四。

电泳操作

实验二

（1）质粒DNA的小量制备

1．目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

2．原理

根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。

在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。

尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

4．试剂

pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4.8）（溶液III），RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。

5．实验准备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌）；

溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；

10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；

摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C30min）。

6．操作步骤

（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。

（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！

），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。

pET-his菌：

接种于5mlLB（Amp+）；

pMD18-T菌：

接种于2mlLB（Amp+）

（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。

3管（3×

1.5ml）；

1管（1.5ml）

（4）在沉淀中加入100l溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。

）

（5）加入200l溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（6）加入150l溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（7）15000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！

），加入800l95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（8）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。

15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（9）再加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。

（10）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。

（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！

）。

（11）pMD18-T加入30l无菌蒸馏水或TE缓冲液；

3管pET-his质粒中每管加入10l蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。

待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1lRNaesA。

用记号笔标记后放入冰箱中备用。

（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。

清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告

7．思考

（1）影响本实验结果的因素有哪些？

实验二

（2）质粒DNA电泳鉴定

学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。

不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。

pET-his质粒，pMD18-T-NK载体，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNAHindIII:

23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130bp）。

配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：

Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：

50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存），10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；

6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；

1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液

（1），放入微波炉中烧开（1min）。

50ml正好倒两块小胶。

（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！

（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。

（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。

胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。

在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。

（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。

（5）在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。

根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V（10V/cm），注意正负电极的位置连接正确。

（6）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。

用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。

凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。

（7）剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10lDNA样品。

（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。

用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3lDNA分子量标准物）。

加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。

看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。

切不可使蓝色样品流到孔外。

（9）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。

电泳将进行约30min。

（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。

取出模具和凝胶。

（11）把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。

放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。

放入凝胶成像系统中拍照。

（12）清理垃圾。

染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。

（13）撰写实验报告。

（1）泳道中的质粒DNA有几条带？

为什么？

（2）溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?

影响本实验结果的因素有哪些？

实验三

（1）感受态菌的制备

1．目的:

学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2．原理:

细菌在0CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。

E.coliDH5，E.coliBL21（DE3），LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater

1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；

平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液（灭菌），无菌ddWater，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。

6．操作步骤

（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mlLB（不含抗菌素！

）培养基。

（2）从超低温冰柜中取出DH5菌种和BL21（DE3）菌种，放置在冰上。

在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mlLB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375（<

0.40.6，细胞数<

108/mL，此为关键参数！

以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100L分装到1.5mL离心管中。

可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（1）制作感受太菌的过程中，应注意那些关键步骤？

（2）CaCl2溶液的作用是什么？

实验三

（2）细菌转化

学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。

然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddwater，IPTG，X-gal。

无菌ddwater，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2%X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

6．操作步骤

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。

（3）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。

（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μLLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（6）在超净工作台中取上述转化混合液100300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：

玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μL2%X-gal，7μL20%IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。

注意白色菌斑。

（1）影响转化效率的因素有哪些？

（3）白色菌落出现的原理是什么？

实验四聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段

一、实验目的

掌握PCR的原理；

学会使用PCR仪；

能利用已知序列设计引物进行一般的PCR实验。

二、实验原理

类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；

而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；

在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。

这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。

如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

三、实验试剂及器材

实验器材：

PCR仪、移液器

实验试剂：

PCR反应液：

四、实验步骤

将PCR反应体系加好混匀后，按照下面步骤调好PCR仪，开始扩增

五、注意事项

在加PCR反应体系时，由于涉及试剂较多，容易出现漏加、多加现象，须认真操作，多加注意；

加完反应体系后，应在离心机中稍微离心一下，使所加试剂混匀后再放到PCR仪中反应。

六、实验结果

取5lPCR产物，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。

七、思考题

如果让你来设计一段已知DNA序列的上下游引物，应该注意哪些方面？