EGFP在肿瘤细胞中的表达调控基因工程综合性实验Word格式文档下载.docx

EGFP在肿瘤细胞中的表达调控基因工程综合性实验Word格式文档下载.docx

《EGFP在肿瘤细胞中的表达调控基因工程综合性实验Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EGFP在肿瘤细胞中的表达调控基因工程综合性实验Word格式文档下载.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

人类骨髓干细胞不具有端粒酶活性已经被报道，然而BurnsJS的研究发现，长时间在体外培养的干细胞可能发生癌变，其原因是其开始表达端粒酶。

而肿瘤细胞之所以能够无限增殖，也与其有比正常细胞活跃的端粒酶有关。

hTERT基因的转录机制严格控制着端粒酶的活性的表达，而hTERT基因的转录被hTERT基因启动子调控，hTERT基因启动子是一种在肿瘤细胞中特异启动的启动子，因此，我们构思可以利用hTERT基因启动子，在其下游接入自杀基因，并将其克隆入慢病毒载体中，再借助慢病毒将此融合基因导入骨髓干细胞中，筛选出含有由hTERT基因启动子控制自杀基因的供体骨髓干细胞，当这种移植的骨髓干细胞在植入体内后有形成肿瘤细胞的趋势时，就可以通过自杀基因的表达使用前体药物对有瘤变趋势的骨髓干细胞进行杀灭，这样既不会对受体产生副作用，又可以由此解决骨髓干细胞移植的安全性问题。

因此构建一种靶向表达自杀基因的载体，这种载体转染骨髓干细胞后能很容易筛选，并且被转染的骨髓干细胞能稳定表达自杀基因且不会发生丢失，这将成为骨髓干细胞移植瘤变研究中关键且必要的步骤。

然而，在本研究的前期实验中，我们发现野生型hTERT启动子如其他已知肿瘤组织特异性启动子一样，仍然存在着肿瘤组织转录活性与靶向性较差的问题，而不能保证将导入体内的自杀基因限制在肿瘤细胞中特异性地表达。

因此，如何利用肿瘤细胞中特异性的表达上调因子结合元件对hTERT启动子进行顺式修饰，以提高hTERT启动子在骨髓瘤变细胞中的转录活性是本节研究所关注的重点。

据研究表明，c-Myc基因的大量扩增是促使癌细胞无限增殖的重要原因，转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子上的E-box结合后可以启动hTERT基因的在肿瘤细胞中特异性表达，但在正常细胞中的表达较低甚至缺乏。

通常情况下，在肿瘤细胞中c-Myc表达占优势，c-Myc转录因子（c-Myc或与Max蛋白形成异二聚体复合物）在识别和连接E-box后，激活hTERT基因转录；

而在正常细胞中mad1表达占优势，mad1（或mad1和Max蛋白形成异二聚体复合物）和c-Myc竞争识别和连接E-box后，抑制hTERT基因转录。

进一步的研究表明，在hTERT启动子核心序列上含有两个E-box（5＇-CACGTG-3＇），分别位于hTERT基因起始密码子ATG上游-34和-242位置上.敲除-34位E-box，可使启动子活性下调10倍，与无启动子时的表达水平相似，但缺失或敲除-242bp位置处E-box时，hTERT启动子活性只是不同程度的下降。

说明hTERT启动子核心序列3＇端位置的E-box保守序列对维持hTERT启动子功能具有更加重要的作用。

因此，我们假设c-Myc转录因子与hTERT启动子上的结合元件（E-box）结合（特别是与hTERT启动子核心序列3＇端位置处的E-box保守序列结合）后可以上调hTERT的表达，那么增加hTERT启动子序列上E-box元件（特别是hTERT启动子３＇端的E-box元件）的数量后，势必会引起转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）和转录抑制因子mad1（或mad1与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子结合机会增加，最终导致hTERT启动子在肿瘤细胞中转录活性得到进一步的提高。

材料准备

1质粒、菌株和细胞

质粒pLenti6/V5-D-TOPO（invitrogen）

质粒pUC-ModhTERT　　　　　　　　　　　　（实验室自行化学法制备）

质粒pUC-WThTERT（实验室自行化学法制备）

质粒pGL3-basic　　　　　　　　　　　（Promega）

大肠杆菌菌株ER2925（NEWGENE）

大肠杆菌菌株stab3（invitrogen）

阳离子脂质体liperfectamine2000　（invitrogen）

293T细胞株　　　　（由本实验室提供）

2　主要试剂

氯霉素（购于GIBCO）

卡那霉素（购于GIBCO）

酵母提取物（购于Oxoid）

胰蛋白胨（购于Oxoid）

质粒DNA抽提试剂盒（购于Promega）

DNA凝胶片段回收试剂盒（购于Promega）

琼脂糖（购于Sigma.Co）

Goldenview（购于赛百盛）

Tris:

（购于上海生工）

EDTA:

HCL:

甘油：

3相关工具酶

ＣlaI（购于Promega）

BamHI（购于Promega）

T4DNA连接酶（购于TaKaRa）

PyrobestDNAPolymerase（购于TaKaRa）

4主要实验设备与仪器准备

PCR仪：

TC-312　　（TTECHNE）

恒温摇床：

　（武汉科学仪器厂）

生化恒温培养箱：

（上海跃进医疗器械一厂）

恒温水浴加热器（汉科学仪器厂）

超净工作台：

（苏净安泰中国）

普通高速离心机（Appendorf5417）

低温冷冻离心机（Beckman）

电泳仪：

（北京六仪器厂）

微量蛋白质核酸定量仪（Appendorf）

凝胶成像系统（Bio-RadUSA）

低温冰箱NV-6382E（日本/NV公司）

恒温水浴加热器（武汉科学仪器厂）

紫外分光光度计U-1800（日本日立公司）

超纯水器D7035（BARNSTEADTHERMOLYNE）

5试剂配制

①LB（Luria-Bertani）培养液、平板的配制

1）LB培养液

用天平称取1g酵母提取物、2g胰化蛋白胨、1gNaCl于500毫升的三角烧瓶中，加入200毫升去离子双蒸水溶解，用5mol/LNaOH（约0.2mL）调节pH值至7.0，然后120℃高压蒸汽灭菌20min。

2）LB琼脂平板的配制：

先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入琼脂糖3g，同法高压蒸汽灭菌20min。

从高压灭菌器取出培养基时应轻轻旋动以使熔解的琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中，应使培养基降温至50℃时，加入抗生素等不耐热的物质。

为避免产生气泡，混匀培养基时应采取旋动的方式，然后可直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。

在90mm直径的培养皿需加入30mL培养基，培养基完全凝结后，应倒置平皿并贮存于4℃备用。

3）抗生素贮存液的配制

氯霉素（34mg/mL）:

用少于10毫升的无水乙醇溶解340mg氯霉素，最后定容至10mL。

分装入1.5毫升的离心管中,每管1毫升,于-20℃贮存备用。

氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）：

用少于10毫升的双蒸水溶解1克氨苄青霉素,最后定容致10毫升,再分装入1.5毫升的离心管中,每管1毫升,于-20℃贮存备用。

4）含抗生素液体培养基的配制

氨苄青霉素液体培养基:

在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氨苄青霉素贮存液1毫升,混匀即可.

氯霉素液体培养基:

在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氯霉素贮存液10毫升,混匀即可.

5）含抗生素固体LB培养基的配制

先按上述LB固体培养基配制的方法配制2瓶200mL培养基,经灭菌后待液体温度降至55-60℃时分别加入氯霉素、氨苄青霉素贮存液便得到相应的抗生素固体培养基

6）新鲜氯化钙转化液的配制

在200mL纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54gCaCl2·

6H2O，用0.22滤器过滤除菌，用15mL的离心管分装成10mL小份贮存于－20℃。

制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mL，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。

6）50×

Tris-乙酸（TAE）的配制

50×

浓贮存液：

称量242gTris碱,量取57.1mL冰乙酸,100mL0.5mmol/LEDTA（pH8.0）定容至1000mL。

7）1×

TAE的配制

将配置好的50×

TAE稀释50倍即得到1×

TAE

６感受态大肠秆菌的制备

①保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5a、stab3及ER2925用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16hr）。

②挑取单菌落，接种于2.0mLLB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。

③取0.5mL过夜培养液，接种于100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。

（注：

以下操作均应在冰浴中进行。

）

④将培养液分入两个50mL离心管中，4℃，离心10min（4000rpm），弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl225mL悬浮30min。

⑤4℃离心,离心10min（4000rpm），弃去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液1mL悬浮。

⑥以100μL/管分装入1.5mL离心管中，-70℃冻存备用。

2.2.9质粒的转化

①取2管（100μL）贮存于-70℃DH5α感受态ER2925大肠杆菌置于冰上待用；

②分别加入pLenti6/V5-D-TOPO和pUC57-ModhTERT、pUC57-WThTERT（0.5μg/μL）质粒5μL，旋转混匀，冰浴20min；

③迅速放入42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；

④加入LB液体培养基600μL，于37℃缓摇孵育90min；

⑤培养结束后，12000rpm离心15秒，倾去上清，保留100μL左右的菌液；

⑥将100μL的菌液涂布于含有氯霉素（34μg/m1）抗性的平板LB培养基中,于37℃温箱孵育至胶表面没有液体流动时（约2hr），然后翻转平皿37℃倒置培养16hr。

2.2.10质粒扩增提取

将转化质粒菌株于LB固体培养基上划线，37℃培养16h左右产生克隆后，挑单菌落扩增并重新提取质粒：

①从接种了抗性质粒的培养基中挑选一生长良好的单菌落，小心用无菌牙签挑出，接种至含抗生素的5mlLB液体培养基的试管中，37℃，200r/min振摇过夜。

次日取菌液1.5毫升转入1.5毫升的离心管中，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。

再重复2次，每个1.5毫升离心管共收集4.5毫升过夜菌沉淀。

②每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。

确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

冰浴2分钟。

③最高速（13,000rpm左右）室温离心10分钟。

将上一步骤离心后的上清吸入到质粒纯化柱内。

最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

④在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

⑤将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。

6修饰型hTERT启动子设计与合成

如图2.1示，野生型hTERT（WThTERT）启动子序列取自GENEBANK中序列号为AF098956所记载在hTERT起始子ATG上游序列（-10,-268bp）片段，修饰hTERT（Mod1hTERT）启动子序列是在野生型hTERT启动子的3'

端接入含有3个E-box重复序列（5'

-CTCGAGGACGCACGTGGGCGCACGTGGGCGCACGTG-3'

）而形成，两种hTERT启动子片断用化学法进行合成,并亚克隆入质粒PUC57中，新得到质粒被命名为PUC-WThTERT和PUC-Mod1hTERT。

图2.1野生型hTERT启动子与修饰hTERT启动子结构示意图:

-268至-10之间的序列为野生型hTERT启动子序列；

修饰型hTERT启动子由野生型hTERT启动子和一个含有3个E-box的插入序列连接而成；

-9至-1以及ATG不属于启动子的组成部分。

Fig.2.1SequenceandconstructionofWThTERTpromoterandMod1hTERTpromoter:

thefragmentfrom-268to-10isthesequenceofWThTERTpromoter;

Insertcontainingtheextra3ofE-boxes;

Mod1hTERTpromotersequencewascomposedbybothWThTERTpromotersequenceandinsert.Fragmentsfrom-9to-1andATGareoutofthecompositionofMod1hTERTpromotersequence

７　分子克隆：

从质粒pEGFP-N3中通过PCR扩增EGFP编码基因

引物设计：

上游引物P1：

5´

-AGAACTAGTAGGCGTGTACGGTGGGA-3´

下游引物P2：

-TACACGAGCCCTATCTCGGTCTATTCTT-3´

按以下反应体系进行：

模板（50ng/pl）1μL

上、下游引物各（15pmol/ul）1μL

dNTP（25mmol/L）2μL

TaqDNA聚合酶（5U/ul）0.5μL

Taq缓冲液2.5μL

加无菌双蒸水至25μL

在PCR扩增仪上扩增，反应条件如下：

预变性96℃3min，变性94℃45s，退火52℃30s，延伸72℃120s，共30循环。

目的DNA片段的回收实验步骤如步骤同上。

８　载体构建

pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP:

1）将上述ＰＣＲ操作所得的EGFP片段与线性pLenti6/V5-D-TOPO载体（按１０：

１分子数）共同转入感受态大肠杆菌stab3中，方法同上。

2）回收质粒后进行双酶切鉴定，新得到的质粒命名为pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP。

plenti-WThTERT:

1）将质粒puc57-Mod1hTERT及pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP转入甲基化酶（dcm）阴性的菌株ER2925（新基因公司）大肠杆菌中进行扩增并回收质粒.

2）用限制性内切酶claI和BamH

对质粒puc57-Mod1hTERT及pLenti6/V5-D-TOPO进行过夜消化.

3）凝胶电泳分别回收claI和BamH

消化质粒pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP（无启动子）及Mod1hTERT启动子片段。

4）用T4DNA连接酶将Mod1hTERT启动子片段与pLenti6/V5-D-TOPO（无启动子）片段（分子数２０：

１）进行连接反应，得到的质粒命名为：

plenti-Mod1hTERT.

９　细胞培养

将293T细胞分别接种于内含10%胎牛血清（购于Hyclone）、100μg/ml链霉毒（购于Hyclone）、100μm/ml青霉毒（购于Hyclone）的DMEM培养基中（购于Hyclone）、于12孔细胞培养板中,　转入CO2培养箱中37℃进行培养，待细胞生长融合至40%～60%时，进行质粒转染。

１０　脂质体介导细胞转染

1转染前细胞的处理：

转染前，选取形态好，活力强的培养细胞，细胞计数，用培养液调整细胞悬液的浓度至2×

105/mL并接种于24孔培养板。

然后置于37℃，5%C02，饱和湿度培养箱中培养。

待其密度生长至80%－90%时，改用无血清和无抗生素培养基培养。

2脂质体-质粒DNA的准备：

在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）：

A液：

用不含血清培养基稀释1-10μg的plenti-WThTERT-EGFP和plenti-ModhTERT–EGFP质粒DNA，终量100μl。

B液：

用不含血清培养基稀释2-50μg阳离子脂质体，终量100μl。

3转染准备：

用2mL不含血清的培养液漂洗细胞两次，再加入1mL不含血清培养液。

4转染：

把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

5转染48h后用荧光显微镜观察报告基因EGFP的表达。

１１EGFP表达的激光共聚焦显微镜观察

将plenti-WThTERT-EGFP和plenti-ModhTERT-EGFP质粒载体，在阳离子脂质体介导下，分别转染上述细胞（具体操作详见阳离子脂质体使用说明书）.37℃、5%CO2中培养48h后，用激光共聚焦显微镜下观察感染结果.