分子实验操作步骤.docx
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分子实验操作步骤
实验室操作规范
CTAB法提取水稻基因组DNA
1、将2%CTAB抽提液放置于65℃水浴锅ZHWY-110X中预热（用温度计测实际温度为准目前实验室水浴锅温度调至61℃即可）水浴锅中要加蒸馏水没过加热圈，以浸没离心管中液面高度为宜。
2、将少量新鲜稻叶（芽）折迭后疏松地置于预冷的2ml离心管中。
叶片应尽量摘取嫩叶长约3-4cm，宽约1cm，（切勿贪多，如太多很难磨碎）按Z字形折叠后，用镊子装入离心管的中下部，不能将叶片一长条直接装入，否则叶片会紧贴管壁无法研磨；也不能折叠地太实，否则经液氮冷冻后会成一实体，很难磨碎。
用种子提取DNA时，要先把种子剥皮后，置于研钵中（目前机器研磨仪还不能有效地将种子研磨碎），倒入液氮没过种子，迅速用研磨棒快速研碎，然后将磨碎的种子粉末分装至1.5ML离心管中，大约装至1/4离心管高度为宜。
3、往离心管中加入2个干净的直径4mm的钢珠在叶片的上方，（钢珠可先用70%酒精清洗，直到干净不掉色，无油腻感为宜）注意叶片不能将珠子卡住。
将离心管装入48孔冷冻模块，投入液氮里面冷冻约5分钟（冷冻时间不宜过长，否则离心管会被冻坏，离心管盖经研磨后易破裂），液氮的液面须没过离心管。
迅速将模块平衡夹紧地固定在Geno/Grinder研磨仪上（用于夹紧的垫片共有6片，其中自制塑料泡沫4片，1白，3红；研磨仪配套塑料垫片2片蓝色。
从下往上对齐依次放置白色塑料泡沫、两个并排48孔冷冻模块、三个红色塑料泡沫垫片、两个并排蓝色垫片，盖上盖子），注意夹紧，否则会转飞。
转速1130r/min,时间50s。
4、研磨好后，可将各个离心管转至100格冷冻盒里（要选用先前用过水浴的100格冷冻盒），离心管可开盖隔排放置，便于加药品。
将离心管按顺序排好后，往各管中加已预热好的650ulCTAB抽提液，然后盖好离心管盖，（切记要盖好，否则在之后的实验中会漏药品）用力摇动，以使研磨的碎末与CTAB溶液相溶。
将装有离心管的100格冷冻白孔板用蓝色盒底及橡皮筋捆绑牢固后，置于65℃水浴锅中温育40min以上，20r/min震荡温育。
每10分钟拿出来人工摇匀一次。
如发现离心管有漏的，药品流入水浴锅中的水里，记得做完实验后要把脏水放掉，换干净的蒸馏水，以备下次实验用。
（水浴锅里的水应加蒸馏水，严禁加自来水，自来水脏，易生水垢，影响导电加热）
5、从水浴锅中取出离心管，稍微冷却至室温，加入800ul的氯仿:
异戊醇（24:
1）混合液，盖好盖子，置入100格冷冻盒里，用橡皮筋固定好后，用手翻转摇匀15分钟，直到上层乳白色，下层黑绿色。
（如果临时没空手摇可将其置于QT-3多功能摇床上，100r/min震荡30min以上，期间应每10min拿起来人工摇匀）。
6、在小离心机1-15P上12000r/min离心10min后，小心吸取400ul（若不足400ul可用无水乙醇补足）上清液转移到新的灭菌1.5ml离心管中。
使用离心机一定要先对称配平方可开始离心。
吸上清时小心避免吸到两相液面中间的那层沉淀，条件允许时需提前将蓝色的枪头剪去尖头后再灭菌使用，剪去尖尖的一头即可，也不易剪太多，太多会导致吸不起来上清液。
7、往各上清离心管中加入800ul冰冻预冷的无水乙醇，盖好盖子，小心轻缓混匀，置于－20℃冰箱两小时以上或者过夜沉淀DNA。
8、小离心机1-15P上10000r/min离心8min，小心弃上清，注意勿将白色DNA沉淀倒出。
在纸巾上稍吸干管口水分。
9、加入800ul70%乙醇，轻轻混匀，静置20min后，弃上清，在纸巾上倒吸残余水分。
若沉淀较脏，可洗两次。
10、将离心管直立，置于超净工作台内自然风干DNA。
至离心管壁没有水珠，管底几乎没有水分，DNA透明即可。
DNA若不干或太干影响后续实验。
不干影响DNA纯度，太干DNA溶解慢，易断裂。
11、加入100ul灭菌高纯水（或者是TE）使DNA溶解（一定要充分溶解，底部无
沉淀，若有沉淀，又急着实验用，可用手弹离心管底加速其溶解，不可用震荡仪震荡，否则DNA易断裂），做好标记，4℃冰箱保存备用，若长期保存须贮存于－20℃。
SSR扩增反应
PCR反应
反应试剂
贮存液浓度
终浓度
1个反应加入量
灭菌超纯水
——
——
4.3ul
PCRbuffer（不含Mg2+）
10×
1×
1ul
dNTP
2.5mM
0.1mM
0.4ul
Mg2+
25mM
15mM
0.6
正向引物*
10uM
0.25uM
0.25ul
反向引物
10uM
0.25uM
0.25ul
Taq酶*
5U/ul
1U/10ul
0.2ul
DNA模板
2ng/ul
6ng/10ul
3.0ul
反應試劑
終濃度
8%PAGE
蒸餾水
——
55ml
50×TAE緩衝液
0.5×
0.6ml
40%丙烯醯胺
8%
14ml
10%APS
0.10%
0.
本实验采用的均是10ul反应体系，配制体系时，先配总管充分震荡混匀后再分装至单孔（配总管时应比实际做的量要多出几管），加样的顺序为最先加水，然后是buffer，接着Mg2+，dNTP，正反向引物，Taq酶。
模板在配制体系前直接加至PCR板孔里，待体系加入后放至SIGMA2-16K离心机2000r/min30s离心混匀，在所有成分都加完之后，再往每个反应体系中加一滴矿物油（不要加太多，能盖住体系液面2mm即可）防止混合体系的蒸发。
注意：
根据实际情况也可将引物的量加倍或者减倍，相应的加入水的量减少或增加。
若带厚粗细可适当减少DNA模板浓度，亦可减少引物量；若带暗可适当增加DNA模板浓度，亦可增加引物量。
加酶时枪头刚接触液面即可，严禁伸入液面过多，酶应当是体系中最后加入的成份，且加酶后，后续的操作要快且在冰上进行，因酶在室温易失活。
PCR反应程序
反应程序：
94℃预变性5分钟
35个循环94℃变性30秒
55℃退火30秒
72℃延伸45秒
72℃补充延伸7分钟，
4℃保温，1小时内取出
退火温度可根据实际情况调整。
实际操作中以PTC-100为例，进入主菜单选择文件夹LYQ，选择new1运行程序即可（本程序目前适用SSR扩增反应，若产物片段大还需再摸索该程序是否可用）。
PCR结束后应尽快将PCR板拿出PCR仪，再用100ul电子枪每孔加入2.2ul6Xloadingbuffer，低速2000r/min离心30s混匀，放至4℃待用。
PAGE电泳
将SSR标记的PCR扩增产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
1、将洗净的玻璃长、短板（U型板）平放在操作台上，用95%酒精擦洗干净，晾干，注意标记好正反面。
（玻璃板一定要用纯水洗干净，切勿残留洗洁精，否则拍照时背景会有洗洁精残留物染色后留下的白点）
2、分别将两片垫片整齐地放在长板两侧后（垫片与U型板上端对齐），然后相应的把短板放在上面，使两块板上面边缘对齐，用夹子在两端夹好，使夹子夹住垫片，将板水平放在操作台上。
注意：
擦洗酒精的那两面朝里。
在叠放时，两块板之间，垫片与板之应齐上不齐下。
3、
反应试剂
终浓度
8%PAGE
40%丙烯酰胺
8%
7ml
高纯水
——
27.5ml
50×TAE缓冲液
0.5×
0.3ml
10%APS（催化剂）
0.10%
0.3ml
TEMED（加速剂）
0.0833ul/ml
25ul
总量
——
35.0ml
配制35ml（一板的量）8.0%聚丙烯酰胺凝胶，混合均匀，从U型板U口的一端开始小心倒胶，液面达到两板下端时，开始推着液面往另一端缓缓的边倒边走，直到充满整个板为止。
为防止气泡出现，一定要小心慢倒，若有气泡产生小心用细长软塑料片轻轻将气泡沿着一个方向赶出，然后插入鲨鱼齿状梳子，梳子不应全部插入，应留2mm左右。
静置10-15min（天气冷应适当延长时间，并用取暖器加温）使胶充分聚合。
（若冬天则将APS及TEMED的量加倍）
配方如下：
配胶时加样顺序为高纯水，40%丙烯酰胺，50XTAE，10%APS，TEMED。
TEMED加完后应尽快倒胶，否则很快就会自行凝固，若不是立即倒胶则可先不加TEMED。
若做多板胶，可先将除TEMED成分外，制胶的其余成分先加好混匀后，再分成1板或2板量分别加TEMED，然后尽快倒胶。
注意：
丙烯酰胺浓度可根据分离产物大小进行调整。
丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp）溴酚兰*二甲苯青*
3.5100～2000100460
5.080～50065260
8.060～40045160
12.040～2003070
15.025～1501560
20.010～1001245
4、在电泳槽下槽加入约下槽半高深度的1×TAE缓冲液，能没过胶版底部即可，前后轻轻晃动电泳槽除去底部气泡；（缓冲液无论新旧都要充分混匀后才可电泳用）
5、将已经完全聚合玻璃板胶去除两侧夹子，放到电泳槽内外两侧，注意长板在外短板在内，放置时先将一头浸入缓冲液再缓缓的放下另一头。
两侧靠上端用夹子固定（这里使用的夹子与前面所使用的夹子不是同一种，不要混淆使用）防止上槽缓冲液漏出。
6、向上层电泳槽中倒入部分1×TAE缓冲液，以没过梳子孔2cm为宜，轻轻抓住梳子两端，用力均匀地缓慢水平拔出（一定要在上端电泳槽倒入缓冲液后再拔梳子）。
7、吸取1.5ul样品依次点到凝胶上样孔中，注意，每上完一个样品均要清洗一下tip吸头，枪头内无蓝色的残留即可。
加marker时应换干净的洗头。
（加样品量可视产物浓度而定，有的产物浓度较高，可适当减少上样量，条带会细些。
）
8、插上电极，接通电源（注意电极切勿插反），调恒压100V（电压可调整）（若是新手点样较慢，防止上样孔扩散，点完一板可加大电压约120V跑5min待样完全跑出上样孔入胶后再点对侧的另一板。
点完后要根据PCR产物片段大小调整电泳时间。
时间长短可依样品间大小差异而定，例如，两个亲本大小相差较大，跑半小时就能分开。
相反差异很小的，可延长电泳时间至2-3小时。
另外每次将电泳时所用的电压，时间，预产物大小记录在笔记本上，发送结果时一并标明。
9、电泳完毕之后，关闭电泳仪电源，拔下电极，去除夹子，用小铲轻轻撬开玻璃板，并在点样开始端做标记，小心地将胶放在加有1×TAE缓冲液染液的染色槽中，缓冲液不宜太多，以能没过胶为准。
按每板5ul的量加入Genefinder染液，50r/min避光振荡染色30-50min；
10、轻轻用手托起凝胶的两端，置于凝胶成像系统下，注意做标记的一端放在左边，打开成像系统的电源，电脑电源，运行拍照软件ScionVisCapture。
11、拍照说明：
软件打开后，先预览图像，待位置调整好后，菜单栏点击Image下拉菜单点击snap，软件状态变成processed时，用鼠标选取需要保存的区域，在菜单栏点击file，选择saveselectionas，将图片保存至E:
\2011年中与自己名字相对应的档夹，如实习生将图片存至E:
\2011年\shixisheng，（请勿再另外新建档夹），图片保存时命名方式应与笔记本上记载的统一。
打开D盘，右键选择2011年公文包，点全部更新即可，拷贝图片自行准备无毒U盘。
常用药品配制
2%CTAB抽提液500ml
CTAB（2%）10g
NaCl（1.4mol/L）40.9g
EDTA.Na2.2H2O（20mM）3.7g
Tris-Base（100mM）6.05g
先加400ml蒸馏水，pH调至8.0。
再加蒸馏水
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