糖尿病大鼠肾脏病变及其SnoN蛋白表达的变化Word下载.docx
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Western印迹法检测肾皮质SnoN蛋白的水平;
生物化学方法测血糖、血清胰岛素水平、甘油三酯、总胆固醇、血肌酐及24h尿蛋白;
光镜检查肾组织形态学改变。
结果:
DM组大鼠出现高血糖、高血脂、肾功能和肾组织形态学改变;
HG组血清胰岛素水平、甘油三酯和总胆固醇明显升高,血糖与NC组相比差异无统计学意义;
Western印迹检测发现DM8组肾组织中SnoN蛋白的表达明显低于NC组,且随病程进展逐渐减少,至DM16时减至NC组的64.20%。
结论:
成功复制了2型糖尿病动物模型;
SnoN蛋白的表达变化可能参与了2型糖尿病肾脏病变的发生、发展过程。
【关键词】糖尿病,非胰岛素依赖型;
糖尿病肾病;
大鼠,Sprague-Dawley;
转录共抑制因子SnoN[Abstract]Objective:
Toestablishtype2diabeticratmodelandobserveitsrenallesionsandSnoNproteinexpression.Methods:
Sprague-Dawleyratsweredividedintonormalcontrol,high-fatandhigh-sucrosegroups.High-fatandhigh-sucrosegroupswerethendividedintohigh-fatandhigh-sucrosecontrolsanddiabetesmellitusgroupsaftertakinghigh-fatandhigh-sucrosedietfor12weeks.Thediabeticratswereinjectedwithlowdoseofstreptozotocin(30mg/kg)andwerekilledatthe20th,24th,and28thweeksrespectively.TheSnoNproteinsinrenalcortexweredetectedwithWesternblotting.Bloodglucose,seruminsulinconcentration,trigly-ceride,totalcholesterol,serumcreatinineand24hurineproteinwereexaminedwithbiochemistrymethods.TherenalmorphologyonHEstainedsectionswascheckedwithlightmicroscope.Results:
Diabeticratsshowedhyperglycaemia,hyperlipemia,kidneymorphologicallesionandrenalfunctionchanges.High-sucrosecontrolgroupshowedhyperinsulinemiaandhyperlipemia,butthebloodglucosewasnormal.WesternblottingresultsshowedthattheexpressionofSnoNindiabeticrenaltissuessignificantlydecreased(P0.01).Conclusions:
Ratmodelsoftype2diabetesmellitushavebeenestablishedsuccessfullywhichcanbeusedasadiabeticnephropathymodel.ThechangeofSnoNproteinexpressionmayplayaroleinthemechanismsoftype2diabeticnephropathy.[Keywords]diabetesmellitus,non-insulin-dependent;
diabeticnephrosis;
rats,Sprague-Dawley;
transcriptionco-repressorSnoN糖尿病是严重威胁人类健康的以高血糖为特征的代谢性疾病,其中2型糖尿病(T2DM)的发生在国外占整个糖尿病比例的85%~95%,国内报道则在90%以上[1]。
但目前国内糖尿病的研究多采用大剂量链脲佐菌素(streptozoticin,STZ)诱导的1型糖尿病模型,国外对2型糖尿病的研究亦大多采用价格昂贵的自发性动物模型,并且其特点是遗传因素在发病过程中占主导地位,与临床上的发病特征不完全吻合。
而对于膳食加小剂量STZ注射诱导的与临床发病过程相近的2型糖尿病模型的复制方法,目前尚无统一的标准[2]。
引起糖尿病患者死亡的主要原因是其血管并发症,而糖尿病肾病即是其常见的微血管并发症之一。
以往的研究发现核转录共抑制因子SnoN蛋白的表达变化与STZ诱导的糖尿病大鼠肾病的发生、发展过程密切相关[3]。
2007年8月~2008年8月采用高脂、高糖饮食加小剂量STZ腹腔注射的方法,通过调整饮食结构和饲喂时间探讨2型糖尿病模型的复制,并对其发病过程中肾脏病变及SnoN蛋白的表达变化进行观察。
1材料和方法1.1材料1.1.1动物和试剂Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,雄性,体重(200±
20)g,由贵阳医学院实验动物中心提供。
STZ购于美国Sigma公司;
SnoN抗体购于美国SantaCruz公司;
β-actin单克隆抗体及DAB显色剂和辣根过氧化物酶标记的二抗购于武汉Boster公司;
Western印迹用PVDF膜,3mmWhatman滤纸购于美国milli-pore公司;
胆固醇购于北京双旋微生物培养基制品厂;
胰岛素测定试剂盒购自天津九鼎生物医学工程有限公司;
TG和TC测定试剂盒购自四川迈克有限公司;
考马斯亮蓝测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.1.2主要器材日本京都血糖仪;
高速低温离心机(美国Beckman公司);
核酸蛋白分析仪(美国Amersham公司);
电泳系统及电转移装置(美国Amersham公司);
凝胶成像系统(美国Bio-RAD公司)。
1.2方法1.2.1动物分组将SD大鼠随机分成正常对照组(NC,n=6)、高脂高糖组(HG,n=24)。
高脂高糖组喂养12周后又随机分为高脂高糖对照组(HC,n=6)、糖尿病组(DM,n=18)。
成模大鼠随机分别于糖尿病8周(DM8,n=6)、12周(DM12,n=6)和16周(DM16,n=6)处死。
NC组以常规饲料喂养,各组大鼠均自由饮水。
1.2.2饮食诱导胰岛素水平升高大鼠适应性饲养1周后,HG组以高脂、高糖饲料喂养,饲料组成如下:
67%常规饲料、20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇、1%蛋黄。
喂养12周时,称体重,测空腹血糖,尾动脉取血测血清胰岛素水平。
1.2.3小剂量STZ注射诱导糖尿病高脂、高糖饮食12周后,DM组大鼠按30mg/kg剂量腹腔注射STZ(以pH4.5、0.01mol/L无菌枸橼酸缓冲液配成1%浓度)。
72h后测空腹血糖,血糖值≥13.8mmol/L者作为2型糖尿病大鼠,18只大鼠全部建模成功。
1.2.4动物标本的采集分别于试验的第20周、24周和28周时处死DM8、DM12和DM16各组大鼠,于28周时一并处死NC和HC组大鼠。
处死前代谢笼留24h尿液,称体重,股动脉取血;
开腹取肾脏,称肾重,一侧肾脏固定于4%多聚甲醛,另一肾脏于-80℃保存供Western印迹检测。
1.2.5生化检测氧化酶(GOD-PAP)法测血清葡萄糖;
放免法测血清胰岛素水平;
考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度,尿蛋白浓度与24h尿量的乘积为24h尿蛋白量;
血甘油三酯和胆固醇测定均按试剂说明书操作。
1.2.6肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片,经HE染色后光镜观察肾组织形态学改变。
1.2.7Western印迹检测取-80℃保存的各组大鼠肾皮质,每组100mg,分别加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清,考马斯亮蓝法测定各组蛋白质浓度,每个样品上样150μg,按所测得浓度计算各样品所需体积,加入2倍上样缓冲液煮沸10min。
经12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离,再转移至PVDF膜上,脱脂奶粉室温封闭1h,加入SnoN或β-actin一抗,工作浓度均为1∶100,4℃孵育过夜。
复温45min,TBST洗膜后,加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1∶5000)室温孵育2h,加DAB显色液显色。
凝胶成像系统进行图像分析,用Quantityone软件分析蛋白条带,测定各条带的面积和灰度值,二者乘积为积分灰度值,以SnoN与β-actin的积分灰度值比值为SnoN蛋白相对值,取3次重复测定值之均数。
1.2.8数据分析所有数据以x±
s表示,采用SPSS11.5软件处理,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。
2结果2.1高脂、高糖饮食对各组大鼠体重、血糖及血清胰岛素的影响高脂、高糖饮食12周时,与NC组相比,HG组大鼠体重及血清胰岛素水平显著增加(P0.01);
空腹血糖与NC组相比差异无显著性(P0.05),见表1。
表1饮食对各组大鼠体重、血糖及胰岛素的影响
(1)与正常对照组相比,P0.012.2小剂量STZ注射后对各组大鼠血糖、血清胰岛素、血清甘油三酯及胆固醇的影响注射STZ后8、12及16周,DM各组空腹血糖均明显高于未注射的28周的NC组和HC组,差异有显著性(P0.01);
血清胰岛素较注射STZ前明显下降且显著低于HC组(P0.01),但与NC组相比差异无显著性。
DM组各组血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)均显著高于NC组(P0.01),且随病程进展而升高,至DM12和DM16时显著高于HC组(P0.01)。
见表2。
2.3血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数 大鼠在注射STZ后8周,血肌酐(Scr)、24h尿蛋白(24hurineprotein,24UP)及肾脏指数(kidneyindex,KI)均显著高于NC组和HC组(P0.01),且随病程进展逐渐升高。
HC组与NC组相比血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数差异均无显著性,见表3。
2.4肾组织形态学变化HE染色下见正常组肾小球形态完整、轮廓清晰;
肾小管未见异常。
DM16组肾小球体积增大和表2不同时点糖尿病组的血糖、胰岛素、甘油三脂及胆固醇表3各组大鼠血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数的变化系膜基质增生;
肾小管管腔扩张,上皮细胞脱落,部分肾小管基底膜不完整,间质可见炎细胞浸润。
见图1。
2.5Western免疫印迹结果NC组和HC组大鼠SnoN表达较多,SnoN与β-actin的积分灰度值之比分别为0.81±
0.06和0.94±
0.16,两组间差异无统计学意义。
DM8组为0.63±
0.05,与NC组相比显著减少,随着DM的进展SnoN的表达逐渐减弱,至DM16组时减少为正常组的64.20%(0.52±
0.11)。
见图2。
3讨论2型糖尿病是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两方面缺陷引起的。
其中胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要始发因素,贯穿于2型糖尿病的发生、发展整个过程。
胰岛素抵抗发生后,只要胰腺能维持足够的胰岛素分泌量来克服胰岛素抵抗,那么糖耐量将保持正常或只有轻微受损。
而一旦β细胞功能开始下降,糖耐量将迅速降低,并发展成糖尿病。
目前,国内外2型糖尿病模型的复制多数即根据此原理,先通过高脂、高糖饮食诱导出胰岛素抵抗,再用小剂量STZ损伤胰岛,使胰岛素的分泌减少,进而复制出与临床2型糖尿病发病过程相似的动物模型。
但有关高脂、高糖饲料的配方及饲喂时间尚无统一的标准,为此,本研究参考国内外文献报道的方法并通过调整高脂、高糖配方和延长饲喂时间复制2型糖尿病大鼠模型[4~8]。
本实验中,饲喂高脂、高糖饲料12周时大鼠体重显著高于正常对照组,且血清胰岛素水平显著升高,但血糖与正常组相比无差异。
也就是说,高脂、高糖饮食12周诱导出了高胰岛素血症和胰岛素抵抗。
高脂、高糖饮食诱发胰岛素抵抗的机制可能是由于血清甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平增高,FFA通过糖脂肪酸循环、胰岛素信号转导等多个不同途径抑制糖储存,降低胰岛素敏感性,而导致胰岛素抵抗的发生[9]。
大鼠出现胰岛素抵抗后,再通过注射小剂量STZ(30mg/kg体重)损伤胰腺功能,导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍,最后诱发高血糖。
注射STZ后大鼠胰岛素水平与同期高脂高糖组相比显著降低,与正常对照组相比差异无统计学意义,说明STZ引起胰岛部分破坏,减少了胰岛素的代偿性分泌。
整个实验过程中,成模组大鼠血糖持续在高水平,血清甘油三酯和胆固醇代谢水平亦在不断升高,表明本实验的造模方法稳定且与临床2型糖尿病的慢性发病过程相似。
糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症,主要表现为肾脏肥大,持续性蛋白尿和进行性肾功能衰竭等[10]。
本实验高脂高糖组大鼠各项肾脏指标与正常组相比差异均无显著,糖尿病成模8周时即出现肾脏指数、24h尿蛋白量和血肌酐显著升高,且随病程进展持续增加,说明肾脏出现肥大且其滤过功能受损。
形态学观察发现糖尿病大鼠肾小球体积增大,肾小管管腔扩张,上皮细胞脱落,间质可见炎细胞浸润,说明DM大鼠发生了糖尿病肾病。
因此,本实验动物模型可以作为糖尿病肾病模型进行研究。
SnoN蛋白是TGF-β1/Smads信号通路中重要的核转录抑制因子[11,12]。
本课题组以往的研究显示,该信号通路在单纯STZ注射复制的1型糖尿病模型肾脏病变的发生、发展中起重要的作用,且SnoN蛋白的表达变化与糖尿病肾病的发生、发展密切相关[3]。
本研究结果显示,单纯的高脂高糖组肾组织中SnoN蛋白的表达与正常组相比差异无显著性。
在高脂高糖饮食基础上注射STZ复制成2型糖尿病时,随病程进展SnoN蛋白持续减少,成模16周时减少为正常组的64.20%。
本课题组在对1型糖尿病的研究发现,糖尿病8周时SnoN蛋白已减少为正常组的42%,这可能与2型糖尿病病变发展缓慢有关。
而有关SnoN蛋白在2型糖尿病发生、发展中变化的意义及其与其它信号分子的相互作用关系,有待进一步研究。
【参考文献】[1]高苹,贾汝汉.2型糖尿病肾病大鼠模型的建立[J].中国中西医结合肾病杂志,2007(6):
316-319.[2]余臣祖,张朝宁,刘国安.实验性2型糖尿病动物模型研究进展[J].医学综述,2006
(1):
41-42.[3]刘瑞霞,郭兵,崔龙,等.SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其意义[J].中国病理生理杂志,2008(6):
1188-1192.[4]赵保胜,董淑云.2型糖尿病动物模型的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2005(5):
62-66.[5]LuoJ,QuanJ,TsaiJ,eta1.NongeneticmousemodelsofnonInsulindependentdiabetesmellitus[J].Metabolism,1998(6):
663-668.[6]郭啸华,刘志红,李恒,等.实验性2型糖尿病大鼠模型的建立[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2000(4):
351-355.[7]ReedMJ,MeszarosK,EntesLJ,eta1.Anewratmodeloftype2diabetes:
thefat-fed,streptozotoein-treatedrat[J].Metabolism,2000(11):
1390-1394.[8]DandaRS,HabibaNM,RinconCholesH,eta1.Kidneyinvolvementinanongeneticratmodeloftype2diabetes[J].KidneyInt,2005(6):
2562-2571.[9]ProiettoJ,FilippisA,Nakhla,etal.Nutrient-inducedinsulinresistance[J].MolCellEndocrinol,1999(1-2):
143-149.[10]郭啸华,刘志红,李恒,等.高脂高糖饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点[J].中国糖尿病杂志,2004(5):
290-294.[11]SarkerKP,WilsonSM,BonniS.SnoNisacelltype-specificmediatoroftransforminggrowthfactor-betaresponses[J].BiolChem,2005(13):
13037-13046.[12]TanR,ZhangJ,TanX,etal.DownregulationofSnoNexpressioninobstructivenephropathyismediatedbyanenhancedubiquitin-dependentdegradation[J].AmSocNephrol,2006(10):
2781-2791.