SMCC结构反应解释Word文档格式.docx

SMCC结构反应解释Word文档格式.docx

《SMCC结构反应解释Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SMCC结构反应解释Word文档格式.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

its 

water-soluble 

analog 

are 

heterobifunctional 

crosslinkers 

that 

contain 

N-hydroxysuccinimide 

（NHS） 

ester 

maleimide 

groups 

allow 

covalent 

conjugation 

of 

amine- 

sulfhydryl-containing 

molecules. 

NHS 

esters 

react 

with 

primary 

amines 

pH 

7-9 

to 

form 

amide 

bonds, 

while 

maleimides 

sulfhydryl 

6.5-7.5 

stable 

thioether 

bonds. 

In 

aqueous 

solutions, 

hydrolytic 

degradation 

a 

competing 

reaction 

whose 

rate 

increases 

pH. 

The 

group 

more 

than 

the 

NHS-ester 

but 

will 

slowly 

hydrolyze 

loses 

specificity 

for 

sulfhydryls 

values 

>

7.5. 

For 

these 

reasons, 

conjugations 

usually 

performed 

7.2-7.5, 

（amine-targeted） 

reacted 

before 

or 

simultaneous 

（sulfhydryl-targeted） 

reaction. 

cyclohexane 

ring 

in 

spacer 

arm 

reagents 

decreases 

hydrolysis 

compared 

similar 

do 

not 

this 

ring.1 

This 

feature 

enables 

proteins 

have 

been 

maleimide-activated 

be 

lyophilized 

stored 

later 

molecule. 

Many 

protein 

products 

produced 

manner 

（see 

Related 

Products）. 

often 

used 

prepare 

antibody-enzyme 

hapten-carrier 

conjugates 

two-step 

scheme. 

First, 

amine-containing 

several-fold 

molar 

excess 

crosslinker, 

followed 

by 

removal 

（nonreacted） 

reagent 

desalting 

dialysis;

finally, 

molecule 

added 

already 

attached 

first 

protein. 

soluble 

water 

many 

other 

buffers 

approximately 

10 

mM, 

although 

solubility 

increasing 

salt 

concentration. 

directly 

must 

dissolved 

an 

organic 

solvent 

such 

as 

dimethylsulfoxide

（DMSO） 

dimethylformamide 

（DMF）;

subsequent 

dilution 

into 

buffer 

generally 

possible, 

most 

reactants 

remain 

if 

final 

concentration 

less 

10%. 

Important 

Information 

• 

moisture-sensitive. 

Store 

vial 

desiccant. 

Equilibrate 

room 

temperature 

opening 

avoid 

moisture 

condensation 

inside 

container. 

Dissolve 

needed 

amount 

use 

it 

immediately 

occurs. 

Discard 

any 

unused 

reconstituted 

reagent. 

Do 

solution. 

No-Weigh 

Microtube 

Handling:

Immediately 

use, 

puncture 

microtube 

foil 

pipette 

tip, 

add 

200 

µ

l 

mM 

sodium 

phosphate 

（pH 

7.0-7.5） 

ultrapure 

up 

down 

mix. 

After 

cut 

from 

strip 

discard. 

pouch 

provided. 

Note:

phosphate-buffered 

saline 

（PBS） 

initial 

dissolution 

Sulfo-SMCC;

does 

dissolve 

well 

exceeding 

total 

salts. 

However, 

once 

dissolved, 

solution 

can 

further 

diluted 

PBS 

non-amine 

buffers. 

Avoid 

containing 

（e.g., 

Tris 

glycine） 

during 

conjugation, 

because 

they 

compete 

intended 

If 

necessary, 

dialyze 

desalt 

samples 

appropriate 

phosphate- 

buffered 

（PBS）. 

Molecules 

moiety 

free 

（reduced） 

sulfhydryls. 

Reduce 

peptide 

disulfide 

bonds 

Immobilized 

TCEP 

Disulfide 

Reducing 

Gel 

（Product 

No. 

77712）. 

proteins, 

reduce 

using 

5 

（1:

100 

Bond-Breaker®

Solution, 

77720） 

30 

minutes 

temperature, 

two 

passes 

through 

suitable 

column 

Zeba™ 

Desalt 

Spin 

Columns）. 

Be 

aware 

antibodies） 

may 

inactivated 

complete 

reduction 

their 

Selective 

hinge-region 

IgG 

accomplished 

2-Mercaptoethylamine•HCl 

（2-MEA, 

20408）. 

Sulfhydryls 

molecules 

N-succinimidyl 

S-acetylthioacetate 

（SATA, 

26102） 

2-iminothiolane•HCl 

（Traut’s 

Reagent, 

26101）, 

which 

modify 

amines. 

Procedure 

Two-step 

Protein 

Crosslinking 

Generally, 

10- 

50-fold 

crosslinker 

over 

results 

sufficient 

activation 

enable 

several 

conjugated 

each 

More 

dilute 

solutions 

require 

greater 

fold 

achieve 

same 

level. 

Empirical 

testing 

necessary 

determine 

optimal 

levels 

ratios 

application. 

A. 

Material 

Preparation 

Conjugation 

Buffer:

（PBS 

= 

phosphate, 

150 

chloride, 

7.2;

e.g., 

28372） 

sulfhydryl-free 

Information） 

– 

adding 

EDTA 

1-5 

helps 

chelate 

divalent 

metals, 

thereby 

reducing 

formation 

Desalting 

separate 

modified 

byproducts 

Zeba 

Columns） 

Amine-containing 

（Protein-NH2） 

（Protein-SH） 

B. 

Protocol 

best 

results, 

ensure 

Protein-SH 

prepared 

ready 

combine 

Protein-NH2 

step 

5. 

1. 

Prepare 

Buffer. 

2. 

Add 

determines 

use. 

Suggested 

excesses 

follows 

（also 

see 

Table 

1）:

<

mg/ml 

40-80-fold 

excess.

1-4 

20-fold 

excess. 

5-10 

5- 

10-fold 

Crosslinker 

preparation 

ml 

sample. 

denoted 

parentheses;

then 

listed 

volume 

example, 

contents 

prescribed 

per 

products, 

dry 

weighed 

on 

balance 

2.4 

500 

buffer）. 

Concentration 

（based 

kDa 

protein） 

0.5 

Molar 

Excess 

5X 

20X 

50X 

（in 

water） 

（4.8 

mg/ml*） 

40 

（10 

20 

25 

DMSO 

DMF） 

（3.7 

（1.5 

（1.8 

*Concentration 

completely 

dissolve, 

place 

tube 

under 

hot 

running 

incubate 

50°

C 

bath. 

3. 

Incubate 

mixture 

hours 

4. 

Remove 

equilibrated 

Combine 

mix 

desalted 

ratio 

corresponding 

desired 

conjugate 

consistent 

relative 

number 

activated 

exist 

proteins. 

6. 

there 

no 

harm 

allowing 

proceed 

overnight, 

specified 

time. 

To 

stop 

completion, 

reduced 

cysteine 

times 

Protein-SH. 

efficiency 

estimated 

electrophoresis 

separation 

staining. 

Additional 

Please 

visit 

Pierce 

website 

additional 

information 

including 

following 

item:

Tech 

Tip:

Attach 

antibody 

onto 

glass, 

silica 

quartz 

surface 

scheme 

Maleimide-activated 

Antibody

Antibody-enzyme 

Conjugate

Sulfo-SMCCAntibodyAntibody

AntibodyEnzyme

Enzyme

Figure 

conjugating 

enzyme 

Sulfo-SMCC. 

produce 

mal