微生物实验操作10页Word文件下载.docx

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如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。

6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。

革兰染色

掌握革兰染色的原理及操作。

干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液

主要为细胞壁结构的差异。

G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；

而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。

1.细菌标本的制作

（1）涂片：

无菌操作。

取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。

（2）干燥：

涂片最好在室温中自然干燥。

必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。

（3）固定：

标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。

固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片黏附较牢固。

菌体蛋白质变性后，提高与染料的亲和力。

2.革兰染色

（1）初染：

滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，1min钟后用自来水缓缓冲洗。

（2）媒染：

滴加碘液1-2滴，1min后用自来水缓缓冲洗。

（3）脱色：

加95%酒精数滴，摆动玻片使酒精与细菌充分接触，约20-30s后，立即用自来水缓缓冲洗。

（4）复染：

滴加稀释碳酸品红液，30-60s后，自来水缓缓冲洗。

用吸水纸吸干后，用油镜观察。

镜检后，载片放入消毒缸。

细菌特殊结构的观察

观察并掌握细菌的形态及特殊结构。

细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片；

革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片

示教：

革兰阳性菌：

葡萄球菌，紫色

革兰阴性菌：

大肠杆菌，红色

细菌鞭毛

细菌芽孢

细菌荚膜

细菌的分布

了解细菌在自然界中的分布情况。

普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。

操作步骤：

1.空气中细菌的检查

（1）采用沉降法：

取普通琼脂平板培养基1只，任意置一处，启盖约15分钟，再盖上，37oC培养24小时，观察有无细菌生长。

（2）结果判定：

培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。

2.皮肤表面细茵检查

（1）采用涂抹法:

先在平板底面用记号笔分成两区，作标记，将未消毒的手指在平板的1／2处表面轻轻涂抹划线，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，用消毒后的手指在平板另一1／2处进行涂抹，操作完毕，置37℃培养24小时后，取出观察结果。

培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。

3.咽喉部细茵检查

（1）用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并划线分离，37oC培养24小时后观察结果。

注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象，并可挑取菌落进行革兰染色检查。

口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。

血平板表面有大小和形态不同的菌落，有的菌落周围可见溶血环。

牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。

紫外线杀菌实验

掌握紫外线杀菌的原理，熟悉紫外线杀菌实验的操作。

大肠杆菌，琼脂平板，无菌回形状纸片，接种环，镊子，紫外灯.

紫外线波长范围为240～280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。

其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。

紫外线特点：

紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃。

1.平板密集划线接种。

2.在平板上贴无菌回形纸片。

3.UV照射30min（打开平板盖子）。

4.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。

5.37oC培养24h后观察结果。

细菌代谢产物观察和生长现象

掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。

熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。

各种生化管，大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。

不同菌的酶系统不同，对底物的代谢产物也不同，用生化的实验方法可将产物检测出来，从而对细菌鉴定。

一、细菌代谢产物观察

1.糖发酵实验

将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内，37℃培养18-24h进行观察。

培养基中指示剂为溴甲酚紫。

如能分解葡萄糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。

如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。

如能分解乳糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。

如培养基未变色，仍为紫色，则表明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。

记录符合“-”。

2.枸橼酸盐利用实验

该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。

指示剂是澳麝香草酚兰。

分别接种大肠杆菌和产气杆菌，37℃培养24h进行观察.

若斜面有菌落出现，培养基由原来的绿色变为深兰色，表明细菌能利用枸橼酸钠，记录符合“+”，反之“-”。

3.靛基质吲哚产生实验

能产生色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质。

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，37℃培养48h后，每管各加吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出现红色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基质产生阳性“+”；

反之为阴性：

“-”。

4.硫化氢产生实验

有的细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢。

将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的培养基中，37℃培养18-24h。

若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”，表明产生的硫化氢与培养基中的铅盐（或铁盐）结合，生成黑色的硫化铅（或硫化铁）。

二、细菌生长现象

1、在液体培养基上生长情况

（1）表面生长：

液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。

如枯草杆菌。

（2）混浊生长：

液体均匀混浊，或有少量沉淀。

如大肠埃希菌。

（3）沉淀生长：

液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。

如链球菌。

2、在固体培养基上的生长情况

（1）菌苔：

在琼脂斜面培养基上长成菌苔。

（2）菌落：

在平板上形成肉眼可见的细菌集团，称为菌落。

观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。

（3）色素：

水溶性色素和脂溶性色素。

3、在半固体培养基上的生长情况

有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长，使穿刺线变得模糊不清。

无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种生仍没穿刺生长，穿刺线与周围界限清楚。

凝集实验（玻片法）

掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉凝集反应的操作。

伤寒杆菌A－F群O多价血清、志贺氏痢疾多价血清、生理盐水、未知菌、玻片。

颗粒性抗原（凝集原）与相应的抗体（凝集素）直接结合，在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。

如红细胞ABO血型的测定，测定细菌的细菌凝集实验。

1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。

于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌A－F群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清，第三格内滴加约30ul生理盐水。

2.用接种环挑取待检菌种少许，分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。

接种环每次使用前后均需经酒精灯火焰烧灼灭菌。

3.轻轻摇动玻片，数分钟后用肉眼观察结果，出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应；

仍为均匀混悬液者为阴性反应。

如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。

沉淀反应（双扩散）

掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉沉淀反应的操作。

干净玻片，玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG

将抗原与抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中，抗原与抗体双方自由扩散，在最适当比例处形成抗原抗体复合物（沉淀线）。

1.制板：

取干净玻片一片，用蜡笔分为三格，用吸管将4－5ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格，制备琼脂板。

2.打孔：

待琼脂板凝固后，用打孔器打孔。

孔间距约为5mm。

3.封底：

将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。

4.加样：

用微量加样器在三孔中加入生理盐水，正常人血清IgG和马抗人IgG。

每孔加入约10μl。

注意：

加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。

5.扩散：

将琼脂板放入湿盘内，置37℃温箱中（均保持水平位置），于24小时后观察结果。

药敏实验（纸片法）

掌握纸片法药敏实验方法，熟悉微生物培养，了解抗生素对细菌的作用机制。

了解含药纸片的制备

大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器（直径6cm），抗生素纸片。

药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，在一定的浓度下，对细菌抑制或杀死，浓度过低，则不能抑制或杀死。

从而形成一定大小的抑菌圈。

1.平板上密集划线接种。

2.贴4-5种含抗生素的纸片于平板上。

药片与平板边缘相距至少1.5cm，药片之间相距至少2cm。

3.37oC培养24h后观察结果。

测量抑菌圈直径大小，判断敏感性。

消毒剂对细菌的影响

掌握含药纸片的制备。

熟悉微生物培养，了解消毒剂对细菌的作用机制。

大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器（直径6cm），滤纸纸片（直径约6mm），70%酒精，金星消毒水，紫药水、红药水。

1.平板上密集划线接种细菌。

2.将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿，在容器边缘沥干，即为含药的滤纸片。

3.将以上含药滤纸片贴于平板上，每块贴4种。

4.37oC培养24h后观察结果。

测量抑菌圈直径大小，判断抑菌效果。

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1、生气，就是拿别人的过错来惩罚自己。

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2、未必钱多乐便多，财多累己招烦恼。

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3、处事不必求功，无过便是功。

为人不必感德，无怨便是德。