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然后根据Stem-Volmer的碰撞理论方程

/F=1+Ksv【Q】，求出Ksv即猝灭常数。

利用Langmuir单分子吸附模型【18】log（（

-F）/F）=logKA+nlg（β-CD-Et）求出结合常数（KA）及结合为点数（n）。

关键词：

β-环糊精;

牛血清白蛋白；

荧光光谱；

荧光猝灭。

Abstract

Inthisarticle,usingsynchronizationfluorescencespectrometryresearchinroomtemperature、PH=7.4Tris-Hclbuffersolution，interactionbetweenBetacyclodextrins（β-CD）andbovineserumalbumin（BSA）.Andinroomtemperature,PH=7.4Tris-Hclbuffersolution,studyonEthylenediaminemodifiedsupramolecularchemistryofcyclodextrinincluding（betaCD-6-EA）tothecowserumalbumindestroyedthecancellationoftherole.Suddenoutintostaticanddynamiccutout【1】.Theresultsofthestudyshowthat:

twosubstancesforthecancellationisthestaticbetweenthem.AndthenbasedontheStem-Volmercollisiontheoreticalequation

/F=1+Ksv【Q】,FindoutKsvnamelycudestroyconstant.UseLangmuirsinglemoleculeadsorptionmodel【18】log（（

-F）/F）=logKA+nlg（β-CD-Et）,Findoutthebindingconstant（KA）andwithpoints（n）.

Keywords:

Betacyclodextrins；

BovineSerumAlbumin；

fluorescencespectrum；

Fluorescencesuddenout

目录

摘要I

前言1

1文献综述3

1.1紫外可见光谱法3

1.1.1紫外可见光谱产生的机理3

1.1.2影响紫外光谱的因素3

1.2荧光光谱法4

1.2.1荧光产生的机理4

1.3荧光猝灭4

1.3.1荧光猝灭的概述（fluorescencequenching）4

1.4环糊精5

1.4.1环糊精结构特点5

1.4.2环糊精的性质5

1.5β-环糊精6

1.5.1β-环糊精的结构特点6

1.6环糊精的改性和应用研究进展7

1.7环糊精的应用8

1.8牛血清白蛋白8

1.8.1牛血清白蛋白的性质8

1.9研究问题的提出及方案设计9

2实验部分10

2.1药品试剂与仪器设备10

2.1.1药品试剂10

2.1.2仪器设备10

2.2样品的配置10

2.2.1缓冲溶液的配置10

2.2.2母液的配置11

2.3β-环糊精与牛血清白蛋白的荧光光谱11

2.4乙二胺修饰的β-环糊精与牛血清白蛋白的荧光光谱12

2.5求结合常数KA和结合位点数n13

2.6乙二胺修饰的β-环糊精与牛血清白蛋白的同步荧光光谱14

结论15

谢辞16

参考文献17

前言

紫外-可见光谱（ultravioletandvisiblespectra）是电子光谱，研究分子中电子能级的跃迁。

引起分子中电子能级跃迁的光波波长范围为10-800nm。

但我们一般研究190~800nm的紫外-可见光区。

该方法具有灵敏度高（10-4-10-6g/ml），准确度高（0.5-2%），操作简便快速，应用范围广。

分子荧光光谱法（Molecularfluorescencespectroscopy）又称为荧光谱法或荧光分析法。

是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据来定性分析，以荧光光谱法的形状和荧光峰对应的波长来定性分析【2】。

该方法灵敏度高，检测限比吸收光谱法低1-3个数量级；

选择性比吸收光谱法好，因为能产生紫外可见吸收的分子不一定能发射荧光；

试样用量少和方法简便；

应用范围较广。

环糊精（Cyclodextrin,简称CD）是一系列环状低聚糖物质的总称。

【3】一般情况包含6-12个D（L）-吡喃葡糖糖单位，它在环糊精糖基转移酶作用下，由淀粉（最主要是支链淀粉）所生成的α-1,4-糖苷键连接、首尾相连、由6～12个葡萄糖单位组成的寡糖。

这种低聚糖物质通常是由芽孢杆菌受环糊精葡糖糖基转移酶的影响，在分解支链淀粉后而产生的。

其中具有重要实际意义并且研究得较多的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为alpha-、beta-和gama-环糊精。

根据红外光谱、X-线晶体衍射和核磁共振波等的实验分析表明：

构成环糊精分子的每个D（+）-吡喃葡萄糖都是椅式构象，且葡萄糖单元均以1，4-糖苷键结合成环。

因为连接葡萄糖单元的糖苷键不能自己偶旋转，所以环糊精是略呈锥形的圆环分子而不是圆筒状分子。

环糊精外侧边缘由于主要由羟基构成而亲水，内腔则因为有较多的氢原子而疏水，环糊精的特殊结构使它能够像酶一样提供一个疏水的结构部位而可以与许多有机或无机疏水客体分子形成包合物[4]。

1891年Villiers通过酶降解淀粉发现了环糊精[5]，1904年Schardinger首次对环糊精的制备做了较详尽描述[6]，1932年Pringsheim首次提出环糊精作为主体分子具有很强的识别客体分子能力[7]。

β-环糊精呈筒状结构，其筒的内部为疏水性，而两端与外部为亲水性，借范德华力将一些大小和形状合适的药物分子包在环状结构中，形成超微囊状包合物，外层的大分子称为“主体分子”，被包合于主分子之内的小分子物质称为“客体分子”。

在alpha-、beta-和gama-环糊精中beta环糊精的研究更为广泛，因为他价格便宜且易得。

由于腔内疏水腔外亲水的两亲性特点[8]，具有与多种客体化合物形成包合物的能力[9]，从而在医药食品、有机合成、反应催化等领域中得到了广泛应用[10]。

在印染中，β-环糊精与染料分子形成包合物，可减慢染料的上染速度，提高染料的匀染性，而且不影响织物的表面色深、日晒牢度[11]。

此外，关于环糊精的修饰、分子聚合、多重识别等研究也多有报道。

修饰后的环糊精衍生物或环糊精聚合物可以作为很好的催化剂或酶模型，被广泛应用于仿生化学、催化等众多领域。

蛋白质是生物体中不可或缺的生命物质，在生命运动和进展中起着不可或缺的作用。

体内血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，它能与许多内源以及外源性化合物结合，起

到存储与转运的作用。

【12】牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分。

则研究牛血清白蛋白与其他物质的相互作用在很多方面面都有很大的作用，如医疗保健食品、调味品；

生化研究、医药研究和遗传工程；

维持渗透压、载体的作用。

本文本文采用采用同步荧光光谱法研究在室温下、PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液中，β-环糊精（β-CD）对牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，并测定在室温下、PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液中,乙二胺修饰的环糊精衍生物（β-CD-6-EA）对牛血清白蛋白猝灭作用的研究。

俩物质之间为静态猝灭。

测定它们之间的结合常数、结合位点数和结合距离。

1文献综述

1.1紫外可见光谱法

1.1.1紫外可见光谱产生的机理

紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。

分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱。

紫外吸收光谱的波长范围是100-400nm（纳米）,其中100-200nm为远紫外区，200-400nm为近紫外区,一般紫外光谱指近紫外区。

用波长范围200nm～800nm的光照射含有共轭体系的的不饱和化合物的稀溶液时，部分波长的光被吸收，被吸收光的波长和强度取决于不饱和化合物的结构。

以波长l为横座标，吸收度A为纵座标作图，得紫外光谱，或称电子光谱。

紫外光谱中化合物的最大吸收波长λmax是化合物紫外光谱的特征常数。

可见－紫外光谱适用于分析分子中具有π键不饱和结构的化合物。

1.1.2影响紫外光谱的因素

（1）.紫外吸收曲线的形状及影响因素

紫外吸收带通常是宽带。

影响吸收带形状的因素有：

被测化合物的结构、测定的状态、测定的温度、

溶剂的极性。

（2）.吸收强度及影响因素

1、能差因素：

能差小，跃迁几率大。

2、空间位置因素：

处在相同的空间区域跃迁几率大。

（3）.吸收位置及影响因素

1.2荧光光谱法

1.2.1荧光产生的机理

当物质分子吸收入射光子的能量之后，发生了价电子从较低能级到较高能级的跃迁，这时分子被激发处于激发态。

这一电子跃迁过程经历的时间约为10-15s[2]。

激发态分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程返回基态。

这一衰变过程伴随着光子的发射，即产生了荧光。

概括地讲，荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数大，激发态的寿命短。

1.2.2荧光与分子结构的关系

分子的价电子被激发到更高能级时，所需要的能量通常在200~600kJ·

mol-1[2]。

虽然许多物质能够吸收紫外和可见光，但是只有一部分物质能够发射荧光，这在很大程度上取决于它们的分子结构。

具有强荧光性的物质往往具有以下特征：

（1）具有大的共轭双键体系；

（2）具有刚性平面结构；

（3）环上的取代基是给电子基团；

（4）其最低的电子激发单重态为（π，π*）型。

1.2.3影响荧光的因素

（1）溶剂极性的影响：

由于“溶剂笼”效应的存在，随着溶剂极性的增加，荧光光谱朝长波长方向移动，发生红移；

倘若荧光体与溶剂间产生了特殊的化学作用（例如形成了氢键），则荧光光谱会发生更大的变化；

含重原子的溶剂，如碘乙烷、四溴化碳等，会使荧光减弱。

（2）介质酸碱性的影响：

具有酸性基团或碱性基团的芳香族化合物，其酸性基团的解离作用或碱性基团的质子化作用可能会影响到其荧光特性。

（3）温度的影响：

随着温度的上升，将导致溶液荧光强度的下降。

（4）溶解氧的影响：

溶解氧的存在往往会使溶液的荧光强度降低。

1.3荧光猝灭

1.3.1荧光猝灭的概述（fluorescencequenching）

荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间所发生的导致荧光强度下降的化学或物理作用过程。

和荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质被称为荧光猝灭剂。

荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。

在利用荧光进行定量等包含荧光过程的测定方法中，一定要注意溶剂、氧气、共存杂质等猝灭剂的影响。

1.4环糊精

1.4.1环糊精结构特点

图1-1是环糊精的分子结构示意图

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6-12个D-吡喃葡萄糖单元。

环糊精外侧边缘由于主要由羟基构成而亲水，内腔则因为有较多的氢原子而疏水，因而有很强的包和性能。

如图可知环糊精不是圆筒状分子而是略呈锥形的圆环。

1.4.2环糊精的性质

环糊精是由淀粉通过环糊精转移酶的作用下经生物转化而产生的一类环状低聚糖物质。

自1891年发现环糊精以来，人们对其做了大量的研究工作【13】。

环糊精由6-8个或更多的D-吡喃葡糖糖连接而成的，形成一个中间有个空腔的截锥行的特殊结构。

其中C2和C3上的羟基官能团位于截锥的第二截面上，而C6位上的官能团固定在了第一界面上。

C5和C3起醚键作用的O原子和无极性的H原子位于环糊精分子空腔的内部。

这一结构特点使得环糊精分子呈现出一个空腔外部亲水，而内部疏水的“微异相环境”【14】。

所以环糊精具有不同于其他非环状结构糖类的特性，从而与很多疏水的分子形成包合物。

所谓包合即主体分子和客体分子，由于分子间的相互作用和相互识别作用，最后使得客体分子部分或全部嵌入主体分子内部的现象。

这一性质是环糊精最重要的性质之一。

最常见的环糊精α、β、γ-环糊精分别是6，7，8个D（+）—吡喃型葡萄糖组成的环状低聚物，其分子呈上宽下窄、两端开口、中空的筒状物，腔内部呈相对疏水性，而所有羟基则在分子外部。

，其中β-环糊精及其衍生物的应用最为广泛。

环糊精类化合物的特点是分子结构中存在一个亲水的外缘和一个疏水的空腔，其疏水的空腔像许多酶一样能够提供疏水结合部位，因而可与许多有机物形成主客体包合物。

某些发光分子对于环糊精的疏水空腔有更大的亲和力，若分子的尺寸大小合适，便能够进入环糊精分子空腔与其形成包合物。

此类包合物稳定性高，并且由于降低了发光分子的活动自由度及对发光分子起了一定的屏蔽作用，在一定程度上增强了其发光性能。

表1-1α-，β-，γ-环糊精部分物理参数和性质[8]

物理参数αβγ

葡萄糖单元数678

摩尔质量9721351297

水中溶解度（g/100ml）14.51.8523.2

[α]150±

0.5162.5±

0.5177.4±

0.5

空腔内径（

）4.7-5.36.0-6.57.5-8.3

空腔深（

）7.9±

0.17.9±

0.1

空腔外径（

）14.6±

0.415.4±

0.417.5±

0.4

空腔近似体积（ml3）174262427

1mol环糊精中近似的空腔体积（ml）104157256

晶形（水中）六方形片状体单斜平行四面体形正方菱

结晶水（wt%）10.213.2-14.58.13-17.7

pKa（25℃）12.33212.20212.081

1.5β-环糊精

1.5.1β-环糊精的结构特点

图1-2β-环糊精分子的结构示意图

β-环糊精是环糊精的一种，分子呈现环状空简行结构，也具有包合作用。

β-环糊精分子是由7个D葡糖糖单元，以α-1,4糖苷键结合成具有环状结构的分子。

具有腔内疏水腔内亲水的两亲性的特点【7】。

β-环糊精是一种白色结晶，在水中比较容易结晶。

在水中的溶解度比较低，在室温下为1.85%，随着温度增加溶解度增加。

不具有吸湿性，但是容易形成稳定的水合物。

在相对湿度50-70%之间的水合程度相当于每分子β-CD吸收10-11个水分子（含水量在13.7-14.8%）。

1.6环糊精的改性和应用研究进展

因为α-CD分子中的空腔较小，通常只有较小的客体分子可以进入生成包合物，其应用范围较小；

而γ-CD分子中空腔较大，但因其高昂的生产成本，工业上无法实现大批量生产，从而限制了其应用；

β-CD分子中的空腔大小适中，又具备生产成本低、应用范围广的特点，使其成为当下工业上应用最多的环糊精产品。

但因β-CD的结构限制，如疏水基团有效表面积、催化活性有限等，使其应用也受到了一定的限制。

研究人员为了改善环糊精类化合物自身存在的一些局限性，尝试用不同方法对环糊精类化合物进行改性。

所谓改性就是指向环糊精分子中引入修饰基团，在环糊精基本骨架保持不变的情况下得到具有不同性能的产物。

目前，国内外关于环糊精类化合物改性方面的研究已取得了很多成果。

改性环糊精也属于超分子化学领域，超分子化学是当前化学研究的一个热门领域，其中以主体对客体的组装和识别为超分子化学研究内容的重要组成部分之一，环糊精化学在过去二三十年内获得了突飞猛进的发展作为一种简单的有机分子，环糊精具有范围及广的各类客体，例如配合物、无机离子、有机分子、甚至稀有气体，通过分子间的相互作用形成主体和客包合物（也称超分子化合物）。

环糊精在香料、调味剂和药物的改性、増溶及其分子包装方面已向世人展示了广阔的应用前景。

尤其在药物中应用广泛。

近年来,对环糊精（cyclodextrin,CD）包合物的研究已取得显著成果,尤其是它在药学领域里的应用令人瞩目。

将药物包埋于CD及其衍生物的空洞中,可改善药物性能,例如增加难溶性药物的溶解度、提高药物的稳定性、控制释放、掩盖药物的缓解局部刺激、不良味道、使液体药物粉末化等，有很大的发展潜力。

1.7环糊精的应用

（1）医药业

环糊精能有效地增加一些水溶性不好的药物在水中的溶解速度和溶解度。

它还能提高药物的生物利用度和稳定性；

降低药物的刺激和有毒性副作用；

减少药物的不良气味或苦味；

以及使药物缓释和改善剂型。

（2）分析化学

环糊精是手性化合物，它对客体分子有进行识别和选择的能力，已成功地应用于各种电泳与色谱方法中,以分离各种对映体和异构体。

环糊精在电化学分析中能改善体系的选择性。

（3）日用化工

环糊精与表面活性剂一起可以用洗衣粉、洗涤剂等日用品中从而减少表面活性剂对皮肤的刺激作用。

（4）环保

因为环糊精能与污染物形成稳定的包合物，从而减少环境污染。

（5）农业

拟除虫菊酯是一类非常重要的杀虫剂，利用环糊精的特殊性可以解决杀虫剂不溶于水，需消耗大量的有机溶剂的问题，也是解决杀虫剂污染环境的有效方法。

1.8牛血清白蛋白

1.8.1牛血清白蛋白的性质

牛血清白蛋白Bovineserumalbumin（BSA）是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为68000g/mol,等电点为4.8。

牛血清白蛋白在生物化学实验中有广泛的应用.白蛋白是血浆中最丰富的载体蛋白质，它能与药物小分子结合，并把他们运输到身体的各个部位，是药物发挥药效的重要载体和靶分子[15-16].蛋白质与药物小分子之间的相互作用是目前化学生物学研究领域中的热点【17】。

用光谱法对蛋白质的研究，对从分子水平上认识生命现象，研究生物小分子和生物大分子相互作用的本质有着很重要的意义，是临床医学、生命科学和化学研究的重要内容之一。

1.9研究问题的提出及方案设计

超分子化学是当前化学研究的一个热门领域，其中以主体对客体的识别和组装为超分子化学研究内容的重要组成部分。

环糊精因其内部空腔疏水，且具有刚性结构，不易变形，在各种介质中均具有良好的稳定性，受到了人们的广泛关注。

本文拟采用荧光光谱法对β-环糊精与牛血清白蛋白相互作用进行初步研究。

实验设计方案如下：

1．配置PH=7.4的缓冲溶液。

2．固定牛血清白蛋白的浓度在不同浓度的β-环糊精情况下测其荧光光谱图。

3．固定牛血清白蛋白的浓度在不同浓度的乙二胺修饰的β-环糊精情况下测其荧光光谱图及同步荧光光谱图。

4．根据Stem-Volmer的碰撞理论方程

5．利用Langmuir单分子吸附模型【18】log（（

2实验部分

2.1药品试剂与仪器设备

2.1.1药品试剂

表2-1药品试剂的规格及来源

名称规格来源

β-环糊精生物试剂天津市博迪化工有限公司

乙二胺修饰的β-环糊精分析纯实验室自制

无水乙醇分析纯天津市红岩化学试剂厂

盐酸分析纯

蒸馏水

Tris分析纯

PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液实验室自制

2.1.2仪器设备

荧光光谱仪（RF-5301PC）：

日本岛津；

pH计（PB-10）：

北京赛多利斯仪器系统有限公司；

分析天平（CP124S）：

真空干燥箱（DZ-2BC）：

天津市泰斯特仪器有限公司；

数控超声波清洗器（KQ5200DE）：

昆山超声仪器有限公司；

紫外可见分光光度计德国耶拿

微量注射器（10ml）

其它仪器有：

烧杯（50mL，100mL，250mL），移液管（2mL，5mL），容量瓶（10mL，25mL，50mL，100mL，250mL,1000mL）,具塞管（25ml）

2.2样品的配置

2.2.1缓冲溶液的配置

因为有BSA的存在，缓冲溶液必须模仿生物环境，则配置PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液。

配制方法如下：

准确称取Tris0.605g定容于50ml的容量瓶中。

准确移取0.417mlHcl溶液（w%为36.0%-38.0%）定容于50ml容量瓶中。

最后把上述两种溶液定容于100ml的容量瓶中。

即为PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液。

2.2.2母液的配置

1）配置2×

10-6mol/L的牛血清白蛋白母液：

准确称取0.034g牛血清白蛋白（BSA）于50ml的烧杯中，然后定容于250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置备用。

2）配置1.5×

准确称取0.0255g牛血清白蛋白（BSA）于50ml的烧杯中，然后定容于250ml容量瓶中，用PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液定容至刻度，摇匀，静置备用。

3）配置2×

10-62mol/L的乙二胺修饰的β-环糊精母液：

准确称取1.177g牛血清白蛋白（BSA）于50ml的烧杯中，然后定容于50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置备用。

2.3β-环糊精与牛血清白蛋白的荧光光谱

准确移取浓度为2×

10-6mol/L的牛血清白蛋白母液于1.5ml于具塞管中，再分别移取为浓度为2×

10-4mol/L环糊