学年浙科版选修1 第一部分第2课时 分离以尿素为氮源的微生物 学案Word文档下载推荐.docx

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方法

高压蒸汽灭菌

10mL尿素溶液采用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，其余用高压蒸汽灭菌，60℃时两者混合

上述是选择培养基的是尿素固体培养基。

用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是：

琼脂中含有少量含氮化合物，用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，是为了尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌利用，有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。

思维拓展

　常见选择培养基的用途不同

（1）加高浓度食盐：

用于筛选获得金黄色葡萄球菌。

（2）加青霉素：

用于筛选获得真菌（酵母菌和霉菌），原理是青霉素能破坏原核生物的细胞壁，杀死原核生物。

（3）缺少氮源的培养基：

用于筛选得到自生固氮菌。

（4）缺少碳源的培养基：

筛选自养型微生物。

3．分离原理

尿素固体培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源；

缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能正常生长繁殖，所以，用尿素固体培养基能够筛选出分解尿素的微生物。

例1

　下列有关叙述，不正确的是（　　）

A．脲是一种有机化合物，含有氮元素

B．地表土壤中含有一定量的脲

C．以尿素为氮源的细菌含有脲酶

D．在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性

答案　D

解析　根据反应式：

（NH2）2C＝O＋H2O

2NH3＋CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。

例2

　（2017·

舟山中学期中）尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。

某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：

K2HPO4

NaCl

H2O

葡萄糖

尿素

酚红

琼脂

0.12g

15mL

0.025g

2.0g

0.25mg

0.5g

（1）分解尿素的细菌都能合成，该种细菌在生态平衡中起到什么作用？

。

写出细菌分解尿素的方程式：

（2）根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？

（填“能”或“不能”），原因是

（3）尿素在高温下容易分解，因此常用对尿素进行过滤灭菌，而该器材在进行过滤灭菌操作前应使用法进行灭菌。

答案　

（1）脲酶　参与了氮循环（或维持氮平衡）　（NH2）2C＝O＋H2O

2NH3＋CO2

（2）不能　琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的细菌

（3）G6玻璃砂漏斗　高压蒸汽灭菌

解析　

（1）含有脲酶的细菌通过降解尿素作为其生长的氮源，从而也起到维持生物圈氮元素平衡的作用，脲酶分解尿素的方程式为：

2NH3＋CO2。

（2）从培养基的成分看，因为含有琼脂，所以不能分离出分解尿素的细菌，因为琼脂是一种未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。

（3）尿素在高温下易分解，应采用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，G6玻璃砂漏斗在使用之前，需采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。

二、实验操作

1．实验中的对照设置

（1）实验组：

以尿素固体培养基进行培养。

（2）对照组：

以全营养LB固体培养基进行培养。

2．实验步骤

探究1——实验探究

1．实验步骤

（1）在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。

（2）制备细菌悬液（过程如图1）。

在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10－2土壤稀释液。

依此法制备10－3、10－4和10－5土壤稀释液。

取样时，尽量只取悬液。

摇匀，放在试管架上。

（3）用涂布分离法分离细菌（如图2）。

取10－4和10－5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。

（4）将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24～48h。

观察菌落数。

2．实验结果

培养基

细菌悬液稀释度

10－4

10－5

LB固体培养基

（1）稀释度为10－4的培养基中的平均菌落数多。

（2）在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的平均菌落数少于LB培养基中的平均菌落数，其原因是大多数微生物不能利用尿素为氮源。

（3）在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。

探究2——理性思维

1．结果分析与评价

项目

现象

结论

有无杂菌污染的判断

作为对照的培养皿中无菌落形成

未被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高

培养物中混入其他杂菌

选择培养基的筛选作用

对照培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目

选择培养基具有筛选作用

重复操作的结果

若选取同一种土样，统计结果应该相近

2.注意事项

（1）制备尿素培养基：

除尿素外的其他成分进行高压蒸汽灭菌，尿素经G6玻璃砂漏斗过滤与灭菌后的其他成分（冷却至60℃左右）混合。

（2）梯度稀释时，各浓度做三个培养皿，通常每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。

（3）由于菌体的叠加以及操作过程中菌体的死亡，因此，稀释涂布后统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

（4）细菌悬液取样时，尽量只取悬液。

（5）玻璃刮刀未用时保存在70%酒精中，用时需放在酒精灯火焰上灼烧，主要目的是消除玻璃刮刀上的酒精，以防止酒精对培养皿中微生物的伤害。

例3

　请回答从土壤中分离产脲酶细菌实验的有关问题：

（1）LB固体培养基：

取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加，灭菌备用。

（2）尿素固体培养基：

先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗，故用于过滤除菌。

然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。

（3）取适量含产脲酶细菌的10－4、10－5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是（A.10－5稀释液＋尿素固体培养基　B．10－5稀释液＋LB固体培养基　C．10－4稀释液＋尿素固体培养基　D．10－4稀释液＋LB固体培养基）。

在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。

答案　

（1）琼脂糖　

（2）高压蒸汽　孔径小，细菌不能滤过（3）A　红色环带　氨（或NH3）

解析　

（1）从土壤中分离产脲酶的细菌的LB固体培养基常用琼脂糖作为凝固剂。

（2）培养瓶、培养基等灭菌，常用的方法是高压蒸汽灭菌；

因为G6玻璃砂漏斗孔径比细菌小，用G6玻璃砂漏斗过滤尿素溶液能达到除菌的目的。

（3）稀释倍数越大，且使用含有尿素溶液的培养基，分离出的产脲酶的细菌菌落数目越少，故选A项；

由于脲酶能催化尿素生成NH3，NH3易溶于水形成具有碱性的氨水，培养基中含有酚红，使培养基中形成红色环带。

例4

　（2018·

浙江名校“新高考”联盟）请分析回答以下关于分离以尿素为氮源的微生物实验的问题：

（1）脲酶可以催化尿素分解为，其中碱性物质可以使酚红指示剂变为。

（2）分离以尿素为氮源的微生物，培养基配制必须加凝固剂，培养基在g/cm2压力下灭菌30分钟，冷却至60℃，加入通过的尿素溶液，混合均匀待用。

（3）为了从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物，分离效果比较好的操作方法是采用，采用该方法分离，土壤溶液必须经过处理。

答案　

（1）NH3和CO2　红色　

（2）琼脂糖　500　G6玻璃砂漏斗过滤　（3）涂布分离法　稀释

1．（2018·

浙江名校协作体联考）下列有关“分离以尿素为氮源的微生物”实验叙述，正确的是（　　）

A．对尿素溶液要使用70%酒精浸泡灭菌

B．分离出的菌落继续在固体培养基中扩大培养

C．划线分离法比涂布分离法更易获得单菌落

D．培养基中需加琼脂糖作为凝固剂

解析　对尿素溶液要通过G6玻璃砂漏斗过滤进行灭菌，A项错误；

分离出的菌落需要在液体培养基中进行扩大培养，B项错误；

涂布分离法比划线分离法更容易获得单菌落，相比较而言，后者操作简单，C项错误；

由于琼脂中含有氮元素，因此在分离以尿素为氮源的微生物实验中，凝固剂采用琼脂糖，D项正确。

2．（2017·

宁波效实中学期中）在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；

在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；

在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。

利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出（　　）

A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌

C．固氮细菌、霉菌、放线菌

D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

答案　C

解析　固氮细菌可以在无氮培养基上生长；

青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；

加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。

3．在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应10－6培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。

A同学的结果产生的原因不可能是（　　）

A．土样不同B．培养基污染

C．操作失误D．没有设置对照

解析　实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设置对照无关。

4．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（　　）

A．一个细菌、液体培养基B．许多细菌、液体培养基

C．一个细菌、固体培养基D．许多细菌、固体培养基

5．（2017·

绍兴一中开学考）从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示：

（1）图中物质A为，若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目，宜采用法接种到尿素培养基上，对照组配制的培养基为培养基，若用同浓度的土壤稀释液接种，实验组培养皿中菌落数（填“大于”“等于”或“小于”）对照组。

在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是

。

（2）下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是。

A．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水

B．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素

C．NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素

D．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物

（3）欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养，应使用LB培养基。

答案　

（1）无菌水　涂布（分离）　LB全营养　小于　能利用尿素的细菌产生的脲酶，将培养基中的尿素分解，产生的氨使指示剂呈红色　

（2）B　（3）液体

题组一　分离以尿素为氮源微生物的实验原理与实验设置

1．（2017·

温州瑞安中学期中）土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种（　　）

A．尿素酶B．脲酶

C．蛋白酶D．肽酶

答案　B

解析　能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。

2．用来判断尿素固体选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（　　）

A．未接种的尿素固体培养基

B．未接种的全营养LB固体培养基

C．接种了的全营养LB固体培养基

D．接种了的尿素固体培养基

解析　将菌液稀释相同的倍数，在全营养LB固体培养基上生长的菌落数目应明显多于尿素固体培养基上的菌落数目。

因此，选用接种了的全营养LB固体培养基作为对照。

本实验的变量是培养基的种类，其他方面应相同。

3．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是（　　）

A．筛选出能分解尿素的细菌

B．对分离的菌种作进一步鉴定

C．作细菌的营养成分

D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素

解析　筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂；

在培养基中加入指示剂的目的是对分离的菌种作进一步的鉴定。

4．在培养基中加入尿素（唯一氮源），以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于（　　）

A．选择培养基B．固体培养基

C．液体培养基D．半固体培养基

答案　A

解析　选择培养基是从功能上对培养基进行分类的，B、C、D三项所述的培养基是根据培养基的物理状态进行分类的；

该培养基能分离出以尿素为唯一氮源的细菌，故是一种选择培养基，A项正确。

题组二　分离以尿素为氮源微生物的实验操作与注意事项

5．请选出下列正确的操作顺序（　　）

①土壤取样

②称取1g土壤，加入盛有99mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1mL土壤溶液进行平板涂布

④依次制备10－2、10－3、10－4、10－5的土壤稀释液

A．①→②→③→④B．①→③→②→④

C．①→②→④→③D．①→④→②→③

6．给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是（　　）

A．打开培养皿盖，取一根接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上

B．取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点

C．打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点

D．略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点

解析　接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，否则用未冷却的接种环蘸取稀泥浆会杀灭菌种。

7．（2017·

宁波一中月考）下列关于分离以尿素为氮源的细菌的实验操作中，不正确的是（　　）

A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释

B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板

C．对尿素灭菌应采用121℃、1kg/cm2的高压蒸汽法灭菌

D．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养

解析　分离以尿素为氮源的微生物的实验操作中，将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，便于统计样品中活菌的数目，A项正确；

同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，这样求得的平均值更接近真实值，B项正确；

尿素遇高温会分解，因此不能采用高压蒸汽灭菌法灭菌，应采用G6玻璃砂漏斗进行过滤，C项错误；

生物实验的原则之一是对照原则，将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，排除非测试因素对实验的影响，可使结论更有说服力，D项正确。

8．（2017·

杭州七校质检）下列有关微生物培养的叙述错误的是（　　）

A．在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌

B．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源

C．测定土壤样品中的细菌数目，常用涂布分离法进行菌落计数

D．酵母菌发酵过程产生的乙醇，对其他微生物生长有一定的抑制作用

解析　在对微生物进行培养前，需要对培养基、培养皿等器械进行高压蒸汽灭菌，对要培养的微生物不能灭菌，A项错误；

分离能分解尿素的细菌时，由于尿素中含有氮元素，所以培养基中只添加尿素作为唯一的氮源，B项正确；

计数菌落时，常用涂布分离法，C项正确；

酵母菌发酵过程进行厌氧呼吸产生乙醇，乙醇对其他微生物的生长有一定的抑制作用，D项正确。

题组三　综合应用

9．（2017·

钦州期末）在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于（　　）

A．空白对照B．标准对照

C．相互对照D．条件对照

解析　乙组和甲组实验的培养条件不同，形成了条件对照。

10．（2017·

台州月考）如图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：

（1）该实验培养基不能含有。

A．尿素B．氯化钠

C．葡萄糖D．琼脂

（2）尿素溶液可用使之无菌。

若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是

（3）图中步骤C为。

相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是

（4）如果菌落周围出现色环带，说明该菌落能分泌脲酶。

答案　

（1）D　

（2）G6玻璃砂漏斗过滤　将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现（3）倒平板　单菌落更易分开　（4）红

解析　

（1）分解尿素的细菌是异养微生物，因此培养基中应该加入有机碳源，如葡萄糖；

分离分解尿素的微生物的培养基从功能上划分属于选择培养基，应该以尿素为唯一氮源；

琼脂中含有含氮的化合物，所以该实验培养基不能含有琼脂；

氯化钠是无机盐，是微生物生长需要的营养物质，且能维持一定的渗透压。

（2）尿素溶液可用G6玻璃砂漏斗过滤使之无菌。

若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现。

（3）图中步骤C为倒平板，相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是单菌落更易分开。

（4）如果菌落周围出现红色环带，说明该菌落能分泌脲酶。

11．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好的被植物利用。

生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，下列是从土壤中分离分解尿素细菌的有关问题，请分析回答：

（1）培养基一般用灭菌；

接种环在操作过程中用灭菌；

实验操作者的双手用消毒；

空气用灭菌。

（2）如图是利用法分离微生物。

（3）分析下面培养基的配方：

NaNO3、KH2PO4、NaH2PO4、MgSO4·

7H2O、KCl、H2O、琼脂糖。

若此培养基用于分离分解尿素的细菌，则应除去上述成分，并加入（物质）。

在培养基中加入指示剂，可初步鉴定出该种细菌能分解尿素。

答案　

（1）高压蒸汽灭菌法　火焰灼烧　酒精　紫外灯照射和过滤风　

（2）划线分离　（3）NaNO3　尿素和葡萄糖　酚红

解析　

（1）无菌操作是微生物培养的关键步骤，培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环在操作过程中采用灼烧灭菌，实验者的双手采用酒精消毒，空气采用紫外线和过滤风灭菌。

（2）分析图示可知，图中采用的是划线分离法分离微生物。

（3）若培养分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，分析题中培养基配方可知，应去除含氮化合物NaNO3，需同时加入尿素作为氮源，葡萄糖作为碳源。

培养基中加入酚红指示剂，该指示剂遇NH3变红色，通过颜色反应可以鉴定培养基上的菌种能否分解尿素。

12．（2017·

宁波三中期末）饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。

若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。

以下是科研人员从作物根部土壤中分离出产植酸酶的菌株的过程示意图。

请分析回答下列问题：

（1）为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行，而且要将接种后的培养皿呈状态放置。

（2）接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成。

根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的就能大致推测出样品中的活菌数。

（3）由于植酸钙的不溶解性，使培养基呈白色浑浊状态。

产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶，实验结果显示A～E五种菌株中，是产植酸酶的最理想菌株。

（4）获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行。

答案　

（1）（高压蒸汽）灭菌　倒置　

（2）单个菌落　菌落数　（3）E　（4）扩大培养

解析　

（1）为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿进行（高压蒸汽）灭菌处理，而且须将接种后的培养皿呈倒置状态放置，以防止污染。

（2）接种以前对样品进行稀释的目的是在培养皿表面形成单个菌落；

根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。

（3）根据题意，菌落体积越小，透明圈越大，说明产植酸酶能力越强，故E是产植酸酶的最理想菌株。

（4）获得目的菌后，若用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。

13．请回答下列有关分离以尿素为氮源的微生物的实验的问题：

（1）实验目的是使用含有的培养基分离能产生酶的细菌；

使用作为指示剂，由颜色变化检测酶所催化的反应。

（2）制备尿素固体培养基过程中采用的灭菌方法有、。

（3）下图所示为实验过程，从图中可判断出细菌悬液C的稀释度为，用法分离细菌。

（4）下列关于此实验的叙述，错误的是。

A．土样应从有哺乳动物排泄物的地方取

B．取10－4、10－5的土壤稀释液各0.1mL，分别涂布于全营养LB固体培养基、尿素固体培养基上

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48h

D．在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌

答案　

（1）尿素　脲　酚红　

（2）高压蒸汽灭菌法　G6玻璃砂漏斗过滤法　（3）10－4　涂布分离　（4）D

解析　

（1）分离以尿素为氮源的微生物的实验原理是培养基以尿素为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物（含有脲酶）才能在该培养基上存活，尿素分解后产生NH3，NH3使酚红指示剂变成红色。

（2）制备尿素固体培养基过程中，尿素溶液的灭菌采用G6玻璃砂漏斗过滤，其他成分采用高压蒸汽灭