土壤微生物数量测定方法.docx

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土壤微生物数量测定方法

土壤微生物的分离鉴定及数量测定

（一）培养基的制备

Ⅰ测定微生物总量培养基：

1.细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）

牛肉膏Beefextract5.0g

蛋白胨Peptone10.0g

NaCI5.0g

蒸馏水H201000m1

琼脂15～20g

PH7.2~7.4

制备步骤：

⑴在100mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.

⑵向小铝锅中加入500mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.

⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000mL.

⑷用NaOH或HC1调至pH7.0.用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。

一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。

注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。

如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好.标签表明培养基的名称、配制日期等。

⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.

2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）

可溶性淀粉20g

KNO31g

K2HPO40.5g

MgSO4•7H2O0.5g

NaCl0.5g原0.05g

FeSO4•7H2O0.01g

pH7.2-7.4

制备步骤：

（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量准确称量各种成分。

（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。

（4）分装、包扎、灭菌。

注：

各成分按配方顺序依次溶解，对于微量成分，可预先配成高浓度的溶液，方便配置时量的控制。

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。

另：

倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL（l00ppm）。

3.真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）

葡萄糖10.0g

MgSO4.7H2O0.5g

蛋白胨5.0g

孟加拉红33.4mg（或者每升加1%溶液3.3mL）

K2HPO41g

蒸馏水H201000m1

PH自然（4-5）

制备步骤：

（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量和熔化按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，边加边搅拌,以防糊底,补足水分到所需体积。

再将孟加拉红配成1%的溶液，在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。

（3）分装、加塞、包扎、灭菌。

（4）链霉素的加入由于链霉素受热易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。

注：

⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。

⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。

Ⅱ测定功能菌所用培养基：

1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）

（NH4）2SO42.0g

NaH2PO40.25g

MnSO4·4H2O0.01g

MgSO4·7H2O0.03g

K2HPO40.75g

CaCO35.0g

蒸馏水1000ml

PH7.2

注：

CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。

因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。

下同。

2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）

NaH2PO40.25g

K2HPO40.75g

MgSO4·7H2O0.03g

MnSO4·4H2O0.01g

CaCO31.0g

Na2CO31.0g

NaNO21.0g

蒸馏水1000ml

PH7.2

3.反硝化细菌培养基

柠檬酸钠5.0g

KNO32.0g

KH2PO41.0g,

K2HPO41.0g

MgSO4·7H2O0.2g

蒸馏水1000ml

pH值7.2~7.5

4.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝（Ashby）无氮培养基）

苯甲酸钠1.5g

K2HPO40.2g

MgSO4·7H2O0.2g

NaCl0.2g

CaSO4·2H2O0.1g

PH7.4—7.6

注：

在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。

5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）

K2HPO40.5g

KH2PO40.5g,

MgSO4·7H2O0.5g

蛋白胨5.0g

蒸馏水1000ml

PH7.0~7.2

6.好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）

KH2PO41.0g

FeCl3·6H2O0.1g

MgSO4·7H2O0.3g

CaCl2·6H2O0.1g

NaCl0.1g

NaNO32.5g

pH7.2～7．4

注：

在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。

（二）试剂的配制

1.格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液：

第一液：

将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

第二液：

将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

2.纳氏试剂

甲液：

将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

乙液：

将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。

分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。

保存于棕色瓶中。

取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。

3.二苯胺试剂：

溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后XX加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。

（三）实验器材

1.仪器设备

4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。

2.器材准备

⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。

⑵将9ml水装入试管，灭菌。

⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。

（四）实验方法

1.样品采集

在靠近植株根系部,去除表层0-5cm的表土，采集5-20cm土壤剖面,多点采集,混匀后四分法取1kg,装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。

2.悬液制备

称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，

使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。

此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。

以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。

3.土壤悬液稀释度选择

⑴细菌:

10-4~10-6

⑵放线菌：

10-3~10-5

⑶真菌：

10-2~10-4

以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。

⑷亚硝酸细菌：

10-3~10-6

⑸硝酸细菌：

10-3~10-6

⑹反硝化细菌：

10-4~10-7

⑺好气性自生固氮菌：

10-3~10-6

⑻氨氧化细菌：

10-5~10-8

⑼好气性纤维素分解菌：

10-2~10-5

以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。

4.接种（平板接种技术）

平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.

①斜面菌种接至平板

划线法:

按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.

点接法:

一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.

②菌悬液接至平板涂抹法:

用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.

混菌法:

先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45～50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.

③平板菌种接至斜面

此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.

5.培养

将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。

培养时间由短到长分别为：

⑴真菌：

2～3d；

⑵细菌：

3～4d；

⑶放线菌：

5～7d。

⑷氨氧化细菌：

7～8d；

⑸好气性自生固氮菌：

7～8d；

⑹亚硝酸细菌：

10～14d；

⑺硝酸细菌：

10～14d；

⑻反硝化细菌：

10～14d；

⑼好气性纤维素分解菌：

10～14d；

6.结果观察

⑴亚硝酸细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。

⑵硝酸细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。

此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。

⑶反硝化细菌：

加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。

⑷好气性自生固氮菌：

观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。

⑸氨氧化细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。

⑹好气性纤维素分解菌：

观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。

7.镜检计数

稀释平板菌落计数

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.

⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10-7,10-8,10-9,每一设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个