分子生物学教案.docx

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分子生物学教案

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第一章：

分子生物学绪论

一、分子生物学的基本含义

分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

二、分子生物学的主要研究内容

分子生物学主要包含以下三部分研究内容

1、结构分子生物学：

  是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。

他包扩结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。

2、基因表达与调控

基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译；在个体发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调控），并随着内外环境的变化而不断的加以修正（环境调控）。

原核基因的表达调控主要发生在转录水平，真核基因的表达调控可发生在以下三个方面：

信号转导、转录因子、RNA剪辑。

3、DNA重组技术：

是将不同的DN**段（如基因或基因的一部分）按照人们的设计定向的连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

  DNA重组技术也称为基因克隆或者分子克隆，它实际上包括了一系列的实验技术，最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。

三、分子生物学与其他学科的关系

分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。

生命活动一致性，使得生物学将是在生物学范围内所有学科在分子水平上的统一。

四、分子生物学的发展过程

分子生物学的发展大致可分为三个阶段。

（一）准备和酝酿阶段

1、确定了蛋白质是生命的主要物质基础

19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，并证明酶的本质是蛋白质。

1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。

1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子-胰岛素A链和B链的氨基酸全序列分析。

2、确定了生物遗传的物质是DNA而不是Pr

证明DNA是遗传物质的两个关键性实验：

首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家Avery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。

美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验，也证明DNA是遗传物质。

这两个实验中主要的论点证据是：

生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。

（二）现代分子生物学的建立和发展阶段

1956年A.Kornbery以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。

1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶。

1958年Meselson及Stahl提出并证明DNA半保留复制模型。

1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型。

1972年证实DNA复制开始需要RNA作为引物。

（三）认识并开始改造生命的发展阶段

1、重组DNA技术的建立和发展

1）分子生物学理论和技术的发展阶段

*70年R.Yuan和H.O.Smith发现限制性内切酶

*72年Bery等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功

*77年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒

*79年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素

2）转基因动植物的成功

1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核，得到比原小鼠个体大几倍的”巨鼠“我国将生长激素基因转入鱼受精卵，得到转基因鱼，导入了凝血因子IX基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子IX，能有效地用于血友病治疗。

94年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿。

96年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，我国将蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。

2、基因诊断与基因治疗在医学领域的发展

对遗传疾病的治疗，使变异基因和异常表达的基因变为正常基因，从根本上治愈遗传疾病，这就是基因治疗的基本思想。

1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。

1994我国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。

3.基因组研究的发展

目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。

77年Sanger测定了ΦX174全部5375个核苷酸的序列；78年Fiers等测出SV-40全部5224对硷基序列；80年代λ噬菌体48,502硷基对的序列全部测出；96年测出了大肠杆菌4x106硷基对序列；90年人类基因组计划（HumanGenomeProject）开始实施，测定出人基因组全部3x109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构。

4.单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展

75年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。

80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。

5.细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域

Sutherland1957年发现cAMP、1965年提出第二信使学说。

77年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与cAMP的作用相联系起来，对G蛋白偶联信号转导途径有了新的认识。

随后蛋白酪氨酸激酶途径的发现、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究有了长足的进步。

对细胞中的信号转导途径已经形成了基本的概念

五、分子生物学在农业中的应用

改良作物品质：

提高蛋白质含量和氨基酸组成；提高植物的抗逆性：

抗旱、抗寒、抗病、盐碱。

生物农药：

生物杀虫剂Bt毒蛋白基因；水果的保鲜：

通过反义基因抑制乙烯基因表达；改变花色、花期：

对色素基因的改造来改变花的颜色；调控植物激素基因的表达控制花期；转基因动、植物作为生物反应器生产药用蛋白：

转基因牛、烟草；转基因猪生产人血红蛋白；转基因羊：

澳大利亚、新西兰生产彩色羊毛。

六、现代生物技术的社会伦理问题

新物种的产生：

转基因动植物病毒所带来的未知后果，生物武器等，受到素食者的反对：

种族歧视的借口：

96年从白种人的基因组中分离出抗HIV（爱滋病）基因，其他人种中迄今没有发现该基因的同源序列。

性别检测与克隆人：

已有法律约束，但可以利用胚胎干细胞培育人体所需的器官。

第二章：

DNA的结构与功能

一、DNA的一级结构

1953年Watson和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，阐明了DNA分子的结构特征，提出DNA是遗传分子。

DNA的一级结构：

是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了DNA分子的化学构成。

四种脱氧核糖核苷酸分别表示为：

dAMP、dGMP、dTMP、dCMP。

DNA分子是由这四种不同的脱氧核苷酸，通过3，5-磷酸二酯键连接而成的直链分子。

1．DNA分子的多样性：

组成DNA分子的碱基虽然只有四种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，而构成了DNA分子的多样性。

如：

某一DNA分子是由100个bp组成，它们的可能排列方式就是4100。

实际上DNA链中的碱基数远远超出100个，所以，它们的排列方式几乎是无限的。

即生物的多样性。

因此，DNA中的碱基排列顺序是DNA分子的重要属性。

对一种DNA属性的最基本了解就是测定其碱基的排列顺序一级结构。

二、DNA的物理图谱

DNA的物理图谱：

是DNA分子的限制性内切酶酶解片段的排列顺序，也就是在DN**段上标记出限制性内切酶的位点顺序。

假设有一段DN**段为2450bp，分别有两个XbaI和两个PstI位点，这样每一个单酶切会把此DNA分子切成3个片段，双酶切将产生5个片段。

三、DNA一级结构的测定

双脱氧末端终止法-----Sanger法：

原理是采用核苷酸链终止剂—2ˊ,3ˊ--双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ--ddNTP）终止DNA的延长。

由于它缺少形成3ˊ,5ˊ--磷酸二脂键所需要的3ˊ-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。

根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。

根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DN**段DNA序列分析。

方法：

在A,C,G,T四种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应后，生成具有相同的5末端，而3ˊ端不同的DN**段混合物，经电泳分析后可以从放射自显影上读出DNA序列。

四、DNA的双螺旋结构

Watson和Crick于1953年根据DNA纤维X射线晶体衍射图及其它试验资料，提出了DNA为右手双螺旋结构的科学假设，随后证明他们提出的DNA构象是DNA分子最为常见的结构，通常称为B型DNA。

而DNA分子的结构不是固定不变的，在不同的环境因素，都可促使DNA分子形成不同的构象。

通常情况下可分为两大类：

一类是右手螺旋，如、B-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、A-DNA；另一类是局部的左手螺旋，即Z-DNA。

B-DNA、A-DNA、Z-DNA的主要区别：

1、A-DNA更紧密，每个碱基平面距离为0.256nm，每圈螺旋有11对碱基，螺距为2.8nm；B-DNA碱基距离为0.338nm，每圈螺旋有10对碱基，螺距为3.4nm。

2、C和G之间核苷酸中脱氧核糖的折叠不同，A-DNA是C3’在内，B-DNA是C2’在内。

3、B-DNA大沟、小沟的深度基本是一致的，只是大沟较宽；A-DNA大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。

4、Z-DNA糖-磷酸主链的走向呈“之”字形，分子呈左手螺旋构象。

5、Z-DNA较B-DNA细而舒展，螺旋直径为1.8nm，每个碱基平面距离是0.37nm，每圈含12对碱基，螺距为4.5nm。

6、Z-DNA是C3’在内与A-DNA相同。

7、Z-DNA仅有一条小沟，且较深，含有较高的负电荷密度。

  Z－DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。

比如CGCGCGCG或者CACACACA。

五、DNA的三股螺旋结构

DNA三股螺旋结构概念是在1957年提出来得，至1987年在质粒的酸性溶液中发现了分子内的三股螺旋DNA，将此种构型的DNA称为H-DNA。

它是双螺旋DNA分子中一条链的某一节段，通过链的折叠与同一分子中DNA嘌呤嘧啶双螺旋（其中一条链只有嘌呤AG，另一条链只有嘧啶CT）节段结合而形成的。

DNA形成一种分子间的三股螺旋DNA，从而可在转录水平上阻止基因的转录。

这就是反基因策略，或称反基因技术。

六、DNA超螺旋结构

超螺旋结构是DNA分子高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两类，一般DNA双螺旋结构中每圈是10个bp，大于或小于10会出现正或负超螺旋结构，环状DNA分子常以超螺旋结构存在，并以负超螺旋为主，有利于转录的起始。

七、核小体与染色体

核小体：

DNA双螺旋链,等距离缠绕组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各二分子组成八聚体形成众多核心颗粒,外绕1.75圈左走向的DNA链,每圈约85bpDNA,各颗粒之间为带有H1组蛋白的连接区DNA。

1、组蛋白特征

进化上极端保守性：

不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的。

无组织特异性：

仅有鸟类、鱼类、两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5。

钛链上氨基酸分布的不均匀性：

碱性氨基酸集中分布在N端，而大部分疏水