细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用文档格式.docx

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细胞微粒子所载的微小核糖核酸包括迄今发现的所

有微小核糖核酸，具体包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、

let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、

miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、

miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、

miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、

miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、

miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、

miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、

miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、

miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、

miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、

miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、

miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、

miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、

miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、

miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、

miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、

miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、

miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、

miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、

miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、

miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、

miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、

miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、

miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、

miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、

miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、

miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、

miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、

miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、

miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、

miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、

miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、

miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、

miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、

miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、

miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、

miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、

miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、

miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、

miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、

miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、

miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、

miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、

miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、

miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、

miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、

miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、

miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、

miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、

miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、

miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、

miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、

miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、

miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、

miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、

miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、

miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、

miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、

miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、

miR-98、miR-99a和miR-99b。

4.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载的微小核糖核酸的制备方法，其

特征是由以下步骤构成：

（1）分级离心法，先将血清/血浆或细胞培养液（3000转/分钟）离心30

分钟除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心（80000转/分钟）4小时，取

沉淀便是血清/血浆总的细胞微粒子，或

（2）免疫吸附法，将细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接用免

疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接和培养皿或

免疫磁珠温育（30分钟或1小时），不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和

回收，或

（3）过滤法，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接放

在带有100kD滤膜的浓缩离心管，在4000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留

在离心管内被浓缩获得。

5.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载的微小核糖核酸的制备研究方

法，其特征是由以下步骤构成：

（1）RT-PCR方法包括以下步骤：

a提取受试者的血清/血浆和细胞微粒子的总RNA，用0.1％-0.2％的

Triton-X100裂解，裂解后的细胞微粒子和除掉微粒子后的血清/血浆用酚和

氯仿除蛋白后上清直接进行逆转录反应得到cDNA样品；

或者用Trizol试剂提

取细胞微粒子及除掉微粒子后的血清/血浆的总RNA，然后通过RNA逆转录反

应得到cDNA样品；

b用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；

c进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

dEB染色后在紫外灯下观察结果：

（2）Real-timePCR方法包括以下步骤：

Triton-X100裂解，裂解后的细胞微粒子和除掉微粒

子后的血清/血浆用酚和氯仿除蛋白后上清直接进行逆转录反应得到cDNA样

品；

或者用Trizol试剂提取细胞微粒子及除掉微粒子后的血清/血浆的总RNA，

然后通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；

b用微小核糖核酸设计引物；

c加入荧光探针进行PCR反应；

d检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的

量的变化，比较炎症状态下细胞微粒子、除掉微粒子的细胞培养液以及细胞中

的微小核糖核酸的量。

6.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载微小核糖核酸在介导不相邻细

胞间信号传导、遗传物质交换和筛选待测物中的应用，尤其是在各种急慢性传

染病、呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、循环系统疾病、

内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖

系统疾病和运动系统疾病基因治疗中的应用。

7.根据权利要求1所述细胞微粒子所载微小核糖核酸制备的试剂盒，其

特征是，所述试剂盒包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、

miR-98、miR-99a和miR-99b的引物。

8.根据权利要求6所述的细胞微粒子所载微小核糖核酸的试剂盒在评价

受试者的生理或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理或病理状态、筛选

待测物，尤其是在各种疾病包括各种肿瘤、各种急慢性传染病、呼吸系统疾病、

免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、

神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病的诊断、治疗、

预后中的应用。

说明书

本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及细胞微粒子所载微小核糖

核酸的制备方法及其在疾病治疗方面的应用。

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非

编码单链小核糖核酸分子。

它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理

活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时