Ion Matepair文库构建方法Word格式文档下载.docx
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1000
TreatmentTime（s）
600
Temperature（℃）
20
SampleVolume（ul）
200
3.末端修复
使用Mate-PairedLibraryEnzymeModule
按照以下条件配置体系：
Compoent
3-kblibrary
ShearedDNA
<
67uL
5×
ReactionBuffer
20.0uL
10mMdNTP
4.0uL
EndPolishingE1
EndpolishingE2
5.0uL
Nuclease-freeWater
Vareis
Total
100uL
室温（20-25℃）下放置30min。
将以下体系加入到上述反应体系中：
Component
20%SDS
8.5uL
10×
BlueJuiceGelLoadingBuffer
10.0uL
65℃变性处理10min，冰上放置5min后，准备琼脂糖凝胶分离和切胶回收
4.琼脂糖凝胶电泳及切胶回收
准备1%琼脂糖凝胶分离3-kb片段
配置琼脂糖胶
Volume
1×
TAE
20.0mL
Agarose
0.2g
Du-red稀释液
20uL
20mL
使用大孔梳子做成一块分离胶，待胶凝固之后放入电泳槽中，点入Marker和样，120V，80mA电泳20-30min，使用胶回收试剂盒进行切角纯化。
5.样品定量
使用Qubit2.0对纯化后的DNA片段进行定量。
——StoppingPoint——
第二部分：
环化
1.计算MP接头加入量：
公式：
需要加入MP接头的量（uL）Y
配置以下体系：
End-repairedDNA
60uL
ReactionBuffer
MPRAdaptor（ds）,25uM
YuL
MPLAdaptor（ds）,25uM
T4DNALigase,5U/uL
VariableuL
2.磁珠纯化
1）准备体系
Samplereaction
150uL
AgencourtAMPure®
XPReagent
200uL
450uL
a.震荡混匀15s后，瞬时离心
b.室温下（20-25℃）放置5min
c.将LoBind离心管放置到磁力架上至少1min，待溶液澄清后，除去上清液
2）保持离心管在磁力架上，使用新配置的70%乙醇洗涤2遍
a.向离心管内加入600uL新配的70%乙醇
b.保持离心管在磁力架上1min，小心除去上清
3）取下离心管，瞬时离心后，将离心管放回磁力架，待溶液澄清后，使用20uL枪头除去剩余的乙醇
4）打开离心管，室温下干燥3min，除去多余的乙醇
5）洗脱
a.将离心管从磁力架上取下，向管内加入50uLElutionBuffer（E1）
b.漩涡混匀15s，瞬时离心，室温下放置3min
c.将离心管放回到磁力架上至少1min，至溶液变得澄清
d.将上清液放置到一支新的1.5mLLoBind离心管
3.Qubit定量
使用Qubit2.0对回收的DNA片段进行定量
回收片段/始上样量
处理
>
5%
进行环化处理
可进行环化处理，但后续的纯化步骤需保证回收量
≤50ng
重新进行文库构建
4.环化DNA
分子内杂交形成环状DNA分子
处理：
1）计算体积处理
DNA体积VDNA=50uL，DNA浓度=xng/mol，T=100xuL
DNA
VuL
Plasmid-Safe™Buffer
T/10uL
T-（T/10）-VuL
TuL
混合产物放置到PCR仪上，70℃处理5min，然后迅速放置到冰上5min
2）环状DNA分离
使用Plasmid-Safe™DNase除去未环化DNA。
处理过后，使用磁珠纯化
Plasmid-Safe™DNase处理
CircularizedDNA
T*uL
ATP100mM
T/100uL
Plasmid-Safe™DNase,10U/ul
*T=环化DNA反应体系的总体积
37℃处理40min
磁珠纯化
1）配置体系：
BeadDilutionBuffer
0.7×
0.3×
a.漩涡震荡15s，瞬时离心
c.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清，除去上清液
2）洗涤DNA2次，使用新配制的70%乙醇
a.加入600uL70%乙醇到离心管中
b.保持离心管在磁力架上至少1min，除去上清
3）将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，放回磁力架。
使用20uL枪头除去多余的乙醇
4）打开盖子，室温下干燥3min
5）混合
84uL
NickTranslationBuffer
6）洗脱DNA
a.将离心管从磁力架上取下，加入91uL上述混合液
b.轻轻涡旋离心15s，室温下放置3min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液变得澄清
d.将上清液转移到一支新的0.2mL离心管中
5.缺口修复与纯化
缺口修复
注意：
该步骤保温过程在PCR仪上进行时，需将热盖关闭，否则会对酶造成破坏，在混合之前，分别将酶和反应体系放置到5℃上数分钟
1）向一支0.2PCR管中放入：
DNAse-treated,purifiedDNA
90uL
2）漩涡混匀，离心
3）将离心管放置到PCR仪中，5℃保持2-3min，关闭热盖！
4）取出另一支0.2mL离心管，加入5uLDNA聚合酶Ⅰ，瞬时离心
5）将装有DNA聚合酶Ⅰ的离心管放入PCR仪中，5℃大于1min，关闭热盖
6）设置计时器10min
7）将装有混合反应液的体系加入到装有DNA聚合酶Ⅰ的离心管中，上下吹打5次混匀，放回到PCR仪，关闭热盖
8）开始计时10min
9）将400ulBindingBuffer（B2-S）和异丙醇（55%）装入一支1.5mLLoBind离心管中
10）在孵育的最后阶段，迅速将反应体系加入到上述的混合液中，终止反应
片段纯化
使用SOLiDLibraryMicroColumnPurificationKit
1）将空的PureLinkMicro离心柱10000g离心1min，确定离心柱膜没有鼓起或折叠
2）将DNA加入到分离柱中
a.将nick-translatedDNA和BindingBuffer充分混匀
b.将混合液装入到柱子内
c.室温下10000g离心1min，弃去液体，此时DNA在离心柱膜上
3）洗涤柱子
a.将分离柱放回到收集管内
b.加入650ul混有乙醇的WashBuffer（W1）
c.室温下10000g离心1min，弃去液体
d.室温下14000g离心1min，除去多余的乙醇
4）洗脱DNA
a.将分离柱放入到一直新的1.5mL离心管中
b.加入25ulElutionBuffer（E1）于收集管膜的中央，保持离心管竖直1min
c.室温下14000g离心1min
d.将离心液体放回离心柱中，保持离心柱竖直1min
e.室温下14000g离心1min
离心出来的溶液即纯化的DNA产物
第三部分酶切
1.双酶切
T7核酸外切酶：
本酶作用于双链DNA，沿5’→3’方向除去5’单核苷酸，既能从5’末端起始消化，又能从双链DNA切口或缺口处消化，既能降解5’磷酸化DNA，又能降解5’去磷酸化DNA
S1核酸酶：
是一种高度单链特异性的核酸内切酶，在最适的酶催化反应条件下，降解单链DNA或RNA，产生待5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸，对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体不敏感
T7核酸外切酶处理
1）体系：
Amount
25ul
Buffer4
5.0ul
T7Exonuclease
2.0ul
18.0ul
50ul
2）反应体系37℃孵育15min
3）70℃热处理20min
4）冰上放置5min
S1核酸酶处理
1）使用S1核酸酶稀释Buffer将1ulS1核酸酶稀释至50U/ul
2）体系
3MNaCl
1.7ul
S1Nuclease
53.7ul
3）37℃孵育45min
纯化
使用AgencourtAMPure®
XPReagent磁珠纯化
1）将磁珠充分混匀
2）按照以下体系配置混合液
Volumn
SampleReaction
53ul
95ul
148ul
a.漩涡混匀15s，瞬时离心
b.室温下放置5min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液
3）洗涤2次，保持离心管在磁力架上
a.加入600ul新配置的70%乙醇
b.保持离心管在磁力架上至少1min，除去上清
4）将离心管从磁力架山取下，瞬时离心后将离心管放回磁力架，使用20ul枪头小心除去多余的乙醇
5）打开离心管盖，室温下干燥3min
a.将离心管从磁力架上取下，向管中加入50uLElutionBuffer（E1）
b.漩涡震荡15s，瞬时离心，室温下放置大于3min
c.将离心管放回磁力架上至少1min，至溶液澄清
d.将上清转移到一直新的1.5mL离心管中
2.末端修复
1）准备末端修复体系
使用EndpolishingEnzyme2
T7/S1-digestedDNA
20.0ul
10mMdNTPMix
EndPolishingEnzyme2
26ul
100ul
2）室温下孵化30min
孵化过程中可先做链霉素磁珠的预洗步骤
3）向体系中加入5.0ul0.5MEDTA终止反应
4）准备以下体系
StoppedEnd-repairBuffer
105ul
BeadsBindingBuffer
200ul
400ul
3.与链霉素磁珠相连
1）预洗磁珠
准备1×
BSA缓冲液
100×
BSA
495uL
500ul
2）将装有链霉素磁珠的离心管漩涡混匀，取出50ul到一支新的1.5mLLoBind离心管
3）将500uLBeadsWashingBuffer加入到50ul磁珠中，漩涡震荡15s，瞬时离心
4）将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液
5）加入500ul1×
BSA，漩涡混匀15s，瞬时离心
6）将离心管放回磁力架至少1min，溶液澄清后，除去上清液
7）加入500ulBeadBindingBuffer，漩涡震荡15s，瞬时离心
当DNA末端修复结束后再进行步骤8
8）将离心管放回磁力架至少1min，待溶液澄清后除去上清液
DNA与磁珠连接：
1）将400uLDNA末端修复产物加入到磁珠中，瞬时离心
2）使混合液在室温下旋转震荡30min，瞬时离心
洗涤复合物
1）准备1×
120ul
Nuclease-freeBuffer
480ul
600ul
2）将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清，除去上清
3）洗涤磁珠三次
a.加入500ulBeadWashBuffer，漩涡震荡15s，瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液
4）洗涤及重新悬浮DNA
a.使用500ul1×
ReactionBuffer重新悬浮DNA，漩涡震荡15s，瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清
c.加入87ul1×
ReactionBuffer再悬浮
第四部分Ion文库步骤
1.连接Ion接头
1）加接头
a.配制以下体系
DNA-Beadcomplex
87ul
IonLibraryAdaptorMix+
3.0ul
T4DNALigase,5U/ul
10.0ul
+AdaptorMix配方见附加部分
b.室温下旋转混合反应体系30min
2）洗涤DNA磁珠三次
a.加入500uLBeadsWashBuffer再悬浮，漩涡震荡15s，瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清，除去上清
3）洗涤及再悬浮DNA磁珠复合体
a.加入500ulElutionBuffer（E1）再悬浮DNA，漩涡震荡15s，瞬时离心
c.加入30ulElutionBuffer（E1）使DNA再悬浮
2.缺口修补及文库预扩增
预扩增
1）配制如下体系
PlatinumPCRAmplificationMix
70ul
IonLibraryAmplificationMix
2.5ul
72.5ul
2）将体系旋窝混合，瞬时离心，对照管向其中加入23μLPCR反应体系混合液，标号“PCR#0”
3）将4.0μLDNA-磁珠复合物加入到49.8μLPCR反应混合体系反应液中，旋窝震荡混匀，然后分为2管（约25μL），标号PCR1#、PCR2#
4）使用两个不同的PCR仪按照下面的循环数运行
Sampleno.
Numbersofcycles
16cycles
1
12cycles
2
5）运行
时期
步骤
温度
时间
Holding
72℃
20min
变性
94℃
5min
Cycling
15s
退火
58℃
15s
延伸
68℃
1min
-
4℃
∞
6）电泳结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定适宜的循环数
缺口修补及文库扩增
1）准备反应体系
IonLibraryAmplificationPrimerMix
210ul
2）将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清
3）使用20uL枪头，小心除去上清，留下5-10uLElutionBuffer于体系中，不可将磁珠吸入到枪头中
4）将第一步中的PCR扩增体系加入到DNA-磁珠复合体的离心管中
5）旋窝震荡15s，瞬时离心，将混合液分装到两个新的PCR管中
6）PCR扩增
Cycling（根据预扩增确定的循环数）
使用SOLiD纯化柱对文库进行纯化
1）将装有PureLinkMicroColumn的离心管放入到离心机中，10000g/min预离心1min
2）加入4倍体积混有异丙醇的BindingBuffer（B2-L）于1体积的样品中，充分混匀，将PCR扩增样品混合。
3）将DNA加入到PureLinkMicro纯化柱
a.确定所有PCR扩增产物都被完全收集到一支离心管中
b.10000r/min室温下离心1min，弃去液体，DNA在纯化柱中
c.确定所有的PCR产物都加入到了纯化柱中
4）洗涤柱子
a.将纯化柱放回到原来的离心管中
b.加入650μL含有乙醇的WashBuffer（W1）于纯化柱中
c.室温下10000g/min离心1min，弃去液体
d.14000g/min离心，除去多余的洗脱液
5）洗脱DNA
a.将纯化柱转移到一支新的1.5mL离心管
b.加入25μLElutionBuffer（E1）于纯化柱正中间，保持纯化柱竖直1min
c.14000g/min，室温下离心1min
d.加离心管内的洗脱液再次加入到纯化柱中，保持纯化柱竖直1min
e.室温下14000r/min离心1min
E-gel凝胶回收
使用E-gelSizeSelect2%gel进行条带回收
附加部分：
AdaptorMix配制方法
1.准备材料
PCR仪
移液枪
T4DNA连接酶
SOLiDBufferKit——1×
LowTEBuffer
Oligonucleotides，HPLCpurified
PCRstriptubes
Filteredpipettortips
2.准备IonLibraryAdaptorMix（P1-A）
1）在将Ion文库接头和DNA连接之前，根据以下步骤制备寡核苷酸。
寡核苷酸探针与单链寡核苷酸杂交形成双链寡核苷酸。
Adaptor
OligoName
Sequence
Length
A_TT
T_ad_A_TT
5-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'
30
T_ad_A_TT_comp
5-CTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG*T*T-3'
32
P1
P1a
5-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'
41
P1b
5-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T-3'
43
2）使用1×
LowTE缓冲液将每管寡核苷酸稀释至200uM
3）将相同体积的200uM“T_ad_A_TT”和“T_ad_A_TT_comp”寡核苷酸于5×
T4DNA连接酶Buffer混合，最终使1×
连接Buffer中包含40uM寡核苷酸。
例如：
需要配置100uLIonAdaptorA
200μMT_ad_A_TT
200μMT-ad_A_TT_comp
5✕T4DNALigaseBuffer
40ul
4）在另一支离心管中，加入相同体积的200uM“P1a”和“P1b”寡核苷酸于5×
需要配置100uLIonP1Adaptor
C
升级会员 