ELISA步骤试剂及注意事项.doc

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ELISA步骤、试剂及注意事项

操作步骤

方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

　　1.　包被：

用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

（简称洗涤，下同）。

　　2.　加样：

加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

　　3.　加酶标抗体：

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：

于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

　　5.　终止反应：

于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：

反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：

在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：

　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。

（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

试剂器材

　　1.　试剂

（1）　包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:

NaCO3?

1.59克　NaHCO3　2.93克　　加蒸馏水至1000ml　　

（2）　洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：

0.15M　KH2PO40.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml

　　（3）　稀释液:

牛血清白蛋白（BSA）0.1克　加洗涤缓冲液至100ml　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

　　（4）　终止液（2MH2SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。

　　（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:

0.2MNa2HPO4（28.4克／L）25.7ml　0.1M柠檬酸（19.2克／L）24.3ml　加蒸馏水50ml。

　（6）TMB（四甲基联苯胺）使用液:

TMB（10mg／5ml无水乙醇）0.5ml底物缓冲液（PH5.5）10ml0.75％H2O2　32μl

　　（7）　ABTS使用液:

ABTS　0.5mg　底物缓冲液（PH5.5）1ml　3％H2O2　2μl

　（8）抗原、抗体和酶标记抗体。

　　（9）　正常人血清和阳性对照血清。

　　2.　器材:

（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

注意事项

　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。

有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

（1）　固相载体的选择：

许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。

其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。

目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。

不管何种载体，在使用前均可进行筛选：

用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗体（或抗原）的选择：

将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。

吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。

蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：

即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。

选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。

对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

　　（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：

首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。

然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

　　（4）　酶的底物及供氢体的选择：

对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。

有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。

有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。

底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。

通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。

底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。