酵母预备试剂Word文件下载.docx
《酵母预备试剂Word文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《酵母预备试剂Word文件下载.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
3.YPDAAgar培育板(1L)
YPDagar
70g
L-adeninehemisulphate
4.0.9%NaCl(w/v)(科室拿)1ml:
EP管分装
NaCl:
0.9g
milipore水定容到100ml
灭菌121°
,20min
%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中,500ul每管,室温保留
6.10×
TE(pH=):
(0.1MTris-HCl,10mMEDTA)
●Tris-HCl1.211g/100ml
●EDTA0.37g/100ml
●调剂pH=,121°
7.10×
LiAc(pH=)
●1MLiAc10.202g/100ml
●用醋酸调剂pH=,121°
灭菌20min
1.×
TE/LiAc
的10×
TE+的10×
LiAc加入灭菌水终为10ml
2.50%PEG3350:
●PEG3350:
50g
●已灭菌的milipore水:
定容到100m
●(可用50°
水浴助溶,PEG易吸水,不可灭菌)
3.PEG/LiAc:
现配现用,在超净台中操作,吸取母液到ep管或50ml离心管中
终浓度10ml
PEG335040%8ml50%PEG3350
TEbuffer1×
1ml10×
TE
LiAc1×
LiAc
4.变性的鲱鱼精DNA(10mg/ml):
100°
5min变性
5.milipore水,70%酒精棉球,50ml离心管4个,ep管一盒,15ml试管架,50ml试管架,ep管架
6..x-a-GAL用DMF(dimethylformamide)20mg/ml,
Prepareandautoclave1Loftheappropriatedroputagarmedium
Coolto55°
CAdd2mlofX-a-Gal(20mg/ml)
Spreadingontopremadeagarplates
DiluteX-a-Galto4mg/mlindimethylformamide
Spread200μlonto15cmplates,or100μlonto10cmplatesusingsterileglassbeads
(二)具体方式:
FreezingMediumconsistsofYPDliquidmedium+25%glycerol
◆A:
酵母感受态制备
1.从平板上或保种管中,挑少量酵母,在YPDA平板上划单克隆(10ul+10ul的DDH20),30°
培育3天左右。
2.从平板上别离挑取单克隆(直径2-3mm)到含有3mlYPDA的玻璃试管中(平行做3管)
3.30°
,200rpm,培育8-12h(留宿)
4.取200ul菌液,测OD600
5.选取OD600值最大的一个试管(即活力最高的一个),吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培育基中(培育基装在250ml三角瓶中)?
?
剩下的离心制作甘油菌
6.30°
,200rpm,培育16-20h,直至OD600=将培育好的菌液转入2个50ml离心管,室温离心3000g,3min,弃上清,用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体,并倒入干净的三角瓶中。
7.30°
,200rpm培育直到OD600=(3-5小时)
8.将菌液倒入2个50ml离心管,室温离心,3000g,3min,弃上清,每一个离心管用30ml灭菌水重悬。
9.再次离心,3000g,3min,室温弃上清,每管用×
TE/LiAc重悬。
10.将重悬的菌液转移到2个ep管中,12000rpm,15s
11.弃上清,每管用600ul×
TE/LiAc重悬,将两管重悬菌液并入一管,预备进行转化。
◆B:
酵母质粒转化(pGBKT7。
pGBKT7/n端和c端。
)
小规模转化大规模转化
1.加入质粒DNA(在预冷的EP管中)100-500ng3-5ug
鲑鱼精DNA(变性的,10mg/ml)5ul20ul
加入感受态细胞,轻弹混匀50ul600ul
2.加入PEG/LiAc,轻弹混匀500ul
水浴,每10-15min轻弹混匀30min45min
4.加入DMSO,轻弹混匀20ul160ul
5.42°
水浴,每5-10min轻弹混匀15min20min
6.离心,弃上清最大转速3000g
15s3min
7.用液体YPDA培育基重悬1ml3ml
8.30°
,230rpm,培育90min90min
9.离心,弃上清最大转速3000g
10.用%NaCl重悬1ml15ml
11.涂板在相应的挑选培育基上。
(三)注意事项:
1.转化效率与很多因素有关,酵母活力是一个重要因素,一样制备酵母感受态的细胞必需是没有通过4°
保留的,活化过的,从培育箱中掏出的新鲜酵母。
2.在制备酵母感受态时,不要超过上述的的OD值,要让酵母一直处在生长最旺盛的时期,专门是最后一次培育,OD600的值不要超过
3.酵母转化进程中,没有抗生素,极易染菌,所有实验都在超净台中进行,超净台需提早一天用70%酒精棉擦拭,将第二天用到的物品(如,试剂,试管,架子等)都放入超净台,灭菌留宿,每次进入超净台操作时,需用70%酒精棉擦手消毒。
4.由于酵母生长周期较长,平板一样在培育箱中要放3天左右,因此在倒板时,不可吹得太干,小板晾干10min左右,大板晾干15min左右即可
5.有些挑选培育基需要加入3-AT,必需是在培育基冷却到55°
一下才可加入。
铺板(铺板3个一路做,转化后生长、自我激活、毒性对照)
试剂预备:
预备SD/-Trp板3*3=9个板9*20=180ml~~~200ml
SDselectionmedium()
ForpGBKT7,useSD/-TrpForpGADT7,useSD/-Leu
2.1/10稀释:
100ul目的载体+900ulYPDA板3*3=9个板9*20=180ml~~~200ml
1/100稀释:
10ul目的载体+990ulYPDA
1/5稀释:
10ul目的载体+40ulYPDA
二、Spread100μlof1/10and1/100dilutionontoa100mmplatecontainingtheappropriateSDselectionmedium
三、Incubateplatesupsidedownat30°
Cuntilcoloniesappear(3–5days).
3-5天后,挑取单菌落,5ml的缺点液体培育基中培育12h(留宿),室温离心,3000g,3min。
甘油菌制备取500ul的(YPD+25%甘油)
菌落自我激活和毒性
一、自我激活
1)已预备好的AH109菌株:
pGBKT7-cav3和N端,
2)阳性对照组:
pGBKT7-53(AH109菌株)和pGADT7-T
3)SD/-Trp/X-a-Galplates
在1L中,Coolto55°
C,add2mlofX-a-Gal(20mg/ml).
4)SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Galplates
C,add2mlofX-a-Gal(20mg/ml)
二、实验进程:
100μlofa1/10dilutionanda1/100dilutionofyourtransformationmixtureontoseparate:
SD/-Trp/X-a-Galplates
SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Galplates
二、Expectedresultsafter3–5days:
毒性-中毒
:
AH109competentcells(Section
SD/-Trpagarplates(AppendixD)
SD/-Trpliquidmedium(AppendixD)
二、Transform100ngofthefollowingvectorsusingthesmall-scaletransformationprotocol(Section
pGBKT7(empty)
pGBKT7+clonedbaitgene
3、Spread100μlof1/10and1/100dilutionsofyourtransformationmixturesontoSD/-Trp.
4、Growat30°
Cfor3–5days:
酵母双杂交
一、材料预备、
转化后baitstrain在菌株上长3-5天后
1、EP管,灭菌好的2L烧瓶;
2、Y187-library
3、在SD-Trp板上培育的已经转化入AH109的pGBKT7-cav3/pGBKT7-cav3N端和C端
4、-SD/-Trp液体培育基50ml(250ml烧瓶)+5ml
5、SD培育板
-SD/-Trp4中浓度*3=12个板12*20ml=240Ml~~~~250ml
-SD/-Leu培育板4中浓度*2=8个板8*20ml=160Ml~~~~150ml
-SD/-Leu/-Trp培育板4中浓度*2=8个板8*20ml=160Ml~~~~150ml
------SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal培育板
32个板*20ml=640ml~~~~~650ml
6、2xYPDAliquidmedium:
45ml(50ug/mlkan)
7、liquidmedium50ml(50ug/mlkan)+10ml=60ml
8、Kanamycinsulfate(50mg/ml)
9、YPD+25%glycerolliquid(freezing)medium
P18
对如实验
三、一、Prepareaconcentratedovernightcultureofthebaitstrain(AH109[pGBKT7+Bait])asfollows:
1)Inoculateonefresh,large(2–3mm)colonyofyourbaitstraininto50mlofSD/-Trpliquidmedium.
2)Incubateshaking(250–270rpm)at30°
CuntiltheOD600reaches(16–20hr).
3)Centrifugetopelletthecells(1,000gfor5min),discardthesupernatant.
4)Resuspendthepellettoacelldensityof>
1x108cellspermlinSD/-Trp(4–5ml).[Thecellscanbecountedusingahemocytometer血细胞计算器.]
二、CombinetheLibraryStrainwiththeBaitStrainasfollows:
1)Thawa1mlaliquotofyourlibrarystraininaroomtemperaturewaterbath.取1ml在室温水浴下解冻。
Remove10μlfortiteringon100mmSD/-Leuagarplates(seeAppendixB,SectionBforlibrarytiteringinstructions).
2)Combinethe1mlofLibraryStrainwiththe5mlBaitStraininasterile2Lflask.
3)Add45mlof2xYPDAliquidmedium(with50μg/mlkanamycin).
4)Rinse冲洗cellsfromthelibraryvial小瓶twicewith1ml2xYPDAandaddtothe2Lflask.
3、Incubateat30°
Cfor20–24hr,slowlyshaking(30–50rpm).
4、After20hr,checkadropofthecultureunderaphasecontrastmicroscope(40X).Ifzygotesarepresent,continuetoStep8,ifnot,allowmatingtocontinue,incubateforanadditional4hr.
Noteote:
Azygotetypicallyhasa3-lobedstructure,thelobesrepresentthetwohaploidparentalcellsandthebuddingdiploidcell.
5.Centrifugetopelletthecells(1,000gfor10min).
6.Meanwhilerinsethe2Lflasktwicewith50ml(with50μg/mlkanamycin),combinetherinsesandusethistoresuspendthepelletedcells.
7.Centrifugetopelletthecells(1,000gfor10min)anddiscardthesupernatant.
8.Resuspendallpelletetedcellsin10mlofKanliquidmedium.Measurethetotalvolumeofcells+medium.
.,10mlmedium+mlcells=ml
10、Fromthematedculturespread100μlof1/10,1/100,1/1,000,1/10,000dilutionsoneachofthefollowing100mmagarplatesandincubateat30°
Cfor3–5days.
SD/-Trp
SD/-Leu
SD/-Leu/-Trp(DDO)
11、Platetheremainderoftheculture,200μlper150mmonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal(QDO+X-a-Gal)agarplate(50–55plates).Incubateat30°
Cfor3–8days.或2~4周
Notesotes:
UsingthehigheststringencypossibletodetectactivationofthethreereportersADE2,HIS3andMEL1,resultsinfewerfalsepositives.
Ignoresmallpalecoloniesthatmayappearaftertwodaysbutnevergrowto>
1mmindiameter.TrueAde+,His+coloniesarerobustandcangrowto>
2mm.
12、Calculatethenumberofscreenedclones(diploids)bycountingthecoloniesfromtheSD/-Leu/-Trp(DDO)platesafter3–5days
13、挑取分离良好的菌落划线于QDO/X-Q一GAL平板上,于30℃培育2周,然后仅挑取蓝色菌落再划线于SD/一Trp产Leu(DoubleDropout,DDO)/X一a一GAL平板上,并于30°
C培育1至2周。
从DDO/X-Q-GAL平板挑选蓝色菌落划线于DDO/X-Q-gaL平板上,如此重复3次。
将第三次DDO/X-a-GaL平板分离良好的蓝色菌落划线到QDO/X-a-GaL平板上,并于30℃培育1至2周。
挑取最后一次的QDO/X-a-GaL平板上的蓝色菌落,接种于的SD/-Leu/-Trp培育液,于30℃250Prm摇晃培育2h0。