酵母预备试剂Word文件下载.docx

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3.YPDAAgar培育板（1L）

YPDagar

70g

L-adeninehemisulphate

4.0.9%NaCl（w/v）（科室拿）1ml:

EP管分装

NaCl:

0.9g

milipore水定容到100ml

灭菌121°

，20min

%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保留

6.10×

TE（pH=）：

（0.1MTris-HCl，10mMEDTA）

●Tris-HCl1.211g/100ml

●EDTA0.37g/100ml

●调剂pH=,121°

7.10×

LiAc（pH=）

●1MLiAc10.202g/100ml

●用醋酸调剂pH=，121°

灭菌20min

1.×

TE/LiAc

的10×

TE+的10×

LiAc加入灭菌水终为10ml

2.50%PEG3350：

●PEG3350：

50g

●已灭菌的milipore水：

定容到100m

●（可用50°

水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）

3.PEG/LiAc：

现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中

终浓度10ml

PEG335040%8ml50%PEG3350

TEbuffer1×

1ml10×

TE

LiAc1×

LiAc

4.变性的鲱鱼精DNA（10mg/ml）：

100°

5min变性

5.milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架

6..x-a-GAL用DMF（dimethylformamide）20mg/ml，

Prepareandautoclave1Loftheappropriatedroputagarmedium

Coolto55°

CAdd2mlofX-a-Gal（20mg/ml）

Spreadingontopremadeagarplates

DiluteX-a-Galto4mg/mlindimethylformamide

Spread200μlonto15cmplates,or100μlonto10cmplatesusingsterileglassbeads

（二）具体方式：

FreezingMediumconsistsofYPDliquidmedium+25%glycerol

◆A：

酵母感受态制备

1.从平板上或保种管中，挑少量酵母，在YPDA平板上划单克隆（10ul+10ul的DDH20），30°

培育3天左右。

2.从平板上别离挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃试管中（平行做3管）

3.30°

，200rpm，培育8-12h（留宿）

4.取200ul菌液，测OD600

5.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培育基中（培育基装在250ml三角瓶中）？

？

剩下的离心制作甘油菌

6.30°

，200rpm，培育16-20h，直至OD600=将培育好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。

7.30°

，200rpm培育直到OD600=（3-5小时）

8.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每一个离心管用30ml灭菌水重悬。

9.再次离心，3000g，3min，室温弃上清，每管用×

TE/LiAc重悬。

10.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s

11.弃上清，每管用600ul×

TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，预备进行转化。

◆B：

酵母质粒转化（pGBKT7。

pGBKT7/n端和c端。

）

小规模转化大规模转化

1.加入质粒DNA（在预冷的EP管中）100-500ng3-5ug

鲑鱼精DNA（变性的，10mg/ml）5ul20ul

加入感受态细胞,轻弹混匀50ul600ul

2.加入PEG/LiAc,轻弹混匀500ul

水浴，每10-15min轻弹混匀30min45min

4.加入DMSO,轻弹混匀20ul160ul

5.42°

水浴，每5-10min轻弹混匀15min20min

6.离心，弃上清最大转速3000g

15s3min

7.用液体YPDA培育基重悬1ml3ml

8.30°

，230rpm，培育90min90min

9.离心，弃上清最大转速3000g

10.用%NaCl重悬1ml15ml

11.涂板在相应的挑选培育基上。

（三）注意事项：

1.转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一样制备酵母感受态的细胞必需是没有通过4°

保留的，活化过的，从培育箱中掏出的新鲜酵母。

2.在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，专门是最后一次培育，OD600的值不要超过

3.酵母转化进程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提早一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌留宿，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。

4.由于酵母生长周期较长，平板一样在培育箱中要放3天左右，因此在倒板时，不可吹得太干，小板晾干10min左右，大板晾干15min左右即可

5.有些挑选培育基需要加入3-AT，必需是在培育基冷却到55°

一下才可加入。

铺板（铺板3个一路做，转化后生长、自我激活、毒性对照）

试剂预备：

预备SD/-Trp板3*3=9个板9*20=180ml~~~200ml

SDselectionmedium（）

ForpGBKT7,useSD/-TrpForpGADT7,useSD/-Leu

2.1/10稀释：

100ul目的载体+900ulYPDA板3*3=9个板9*20=180ml~~~200ml

1/100稀释：

10ul目的载体+990ulYPDA

1/5稀释：

10ul目的载体+40ulYPDA

二、Spread100μlof1/10and1/100dilutionontoa100mmplatecontainingtheappropriateSDselectionmedium

三、Incubateplatesupsidedownat30°

Cuntilcoloniesappear（3–5days）.

3-5天后，挑取单菌落，5ml的缺点液体培育基中培育12h（留宿），室温离心，3000g，3min。

甘油菌制备取500ul的（YPD+25%甘油）

菌落自我激活和毒性

一、自我激活

1）已预备好的AH109菌株：

pGBKT7-cav3和N端，

2）阳性对照组：

pGBKT7-53（AH109菌株）和pGADT7-T

3）SD/-Trp/X-a-Galplates

在1L中，Coolto55°

C,add2mlofX-a-Gal（20mg/ml）.

4）SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Galplates

C,add2mlofX-a-Gal（20mg/ml）

二、实验进程：

100μlofa1/10dilutionanda1/100dilutionofyourtransformationmixtureontoseparate:

SD/-Trp/X-a-Galplates

SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Galplates

二、Expectedresultsafter3–5days:

毒性-中毒

:

AH109competentcells（Section

SD/-Trpagarplates（AppendixD）

SD/-Trpliquidmedium（AppendixD）

二、Transform100ngofthefollowingvectorsusingthesmall-scaletransformationprotocol（Section

pGBKT7（empty）

pGBKT7+clonedbaitgene

3、Spread100μlof1/10and1/100dilutionsofyourtransformationmixturesontoSD/-Trp.

4、Growat30°

Cfor3–5days:

酵母双杂交

一、材料预备、

转化后baitstrain在菌株上长3-5天后

1、EP管，灭菌好的2L烧瓶；

2、Y187-library

3、在SD-Trp板上培育的已经转化入AH109的pGBKT7-cav3/pGBKT7-cav3N端和C端

4、-SD/-Trp液体培育基50ml（250ml烧瓶）+5ml

5、SD培育板

-SD/-Trp4中浓度*3=12个板12*20ml=240Ml~~~~250ml

-SD/-Leu培育板4中浓度*2=8个板8*20ml=160Ml~~~~150ml

-SD/-Leu/-Trp培育板4中浓度*2=8个板8*20ml=160Ml~~~~150ml

------SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal培育板

32个板*20ml=640ml~~~~~650ml

6、2xYPDAliquidmedium：

45ml（50ug/mlkan）

7、liquidmedium50ml（50ug/mlkan）+10ml=60ml

8、Kanamycinsulfate（50mg/ml）

9、YPD+25%glycerolliquid（freezing）medium

P18

对如实验

三、一、Prepareaconcentratedovernightcultureofthebaitstrain（AH109[pGBKT7+Bait]）asfollows:

1）Inoculateonefresh,large（2–3mm）colonyofyourbaitstraininto50mlofSD/-Trpliquidmedium.

2）Incubateshaking（250–270rpm）at30°

CuntiltheOD600reaches（16–20hr）.

3）Centrifugetopelletthecells（1,000gfor5min）,discardthesupernatant.

4）Resuspendthepellettoacelldensityof>

1x108cellspermlinSD/-Trp（4–5ml）.[Thecellscanbecountedusingahemocytometer血细胞计算器.]

二、CombinetheLibraryStrainwiththeBaitStrainasfollows:

1）Thawa1mlaliquotofyourlibrarystraininaroomtemperaturewaterbath.取1ml在室温水浴下解冻。

Remove10μlfortiteringon100mmSD/-Leuagarplates（seeAppendixB,SectionBforlibrarytiteringinstructions）.

2）Combinethe1mlofLibraryStrainwiththe5mlBaitStraininasterile2Lflask.

3）Add45mlof2xYPDAliquidmedium（with50μg/mlkanamycin）.

4）Rinse冲洗cellsfromthelibraryvial小瓶twicewith1ml2xYPDAandaddtothe2Lflask.

3、Incubateat30°

Cfor20–24hr,slowlyshaking（30–50rpm）.

4、After20hr,checkadropofthecultureunderaphasecontrastmicroscope（40X）.Ifzygotesarepresent,continuetoStep8,ifnot,allowmatingtocontinue,incubateforanadditional4hr.

Noteote:

Azygotetypicallyhasa3-lobedstructure,thelobesrepresentthetwohaploidparentalcellsandthebuddingdiploidcell.

5.Centrifugetopelletthecells（1,000gfor10min）.

6.Meanwhilerinsethe2Lflasktwicewith50ml（with50μg/mlkanamycin）,combinetherinsesandusethistoresuspendthepelletedcells.

7.Centrifugetopelletthecells（1,000gfor10min）anddiscardthesupernatant.

8.Resuspendallpelletetedcellsin10mlofKanliquidmedium.Measurethetotalvolumeofcells+medium.

.,10mlmedium+mlcells=ml

10、Fromthematedculturespread100μlof1/10,1/100,1/1,000,1/10,000dilutionsoneachofthefollowing100mmagarplatesandincubateat30°

Cfor3–5days.

SD/-Trp

SD/-Leu

SD/-Leu/-Trp（DDO）

11、Platetheremainderoftheculture,200μlper150mmonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal（QDO+X-a-Gal）agarplate（50–55plates）.Incubateat30°

Cfor3–8days.或2~4周

Notesotes:

UsingthehigheststringencypossibletodetectactivationofthethreereportersADE2,HIS3andMEL1,resultsinfewerfalsepositives.

Ignoresmallpalecoloniesthatmayappearaftertwodaysbutnevergrowto>

1mmindiameter.TrueAde+,His+coloniesarerobustandcangrowto>

2mm.

12、Calculatethenumberofscreenedclones（diploids）bycountingthecoloniesfromtheSD/-Leu/-Trp（DDO）platesafter3–5days

13、挑取分离良好的菌落划线于QDO/X-Q一GAL平板上，于30℃培育2周，然后仅挑取蓝色菌落再划线于SD/一Trp产Leu（DoubleDropout，DDO）/X一a一GAL平板上，并于30°

C培育1至2周。

从DDO/X-Q-GAL平板挑选蓝色菌落划线于DDO/X-Q-gaL平板上，如此重复3次。

将第三次DDO/X-a-GaL平板分离良好的蓝色菌落划线到QDO/X-a-GaL平板上，并于30℃培育1至2周。

挑取最后一次的QDO/X-a-GaL平板上的蓝色菌落，接种于的SD/-Leu/-Trp培育液，于30℃250Prm摇晃培育2h0。