生化分离实验版本Word文档格式.docx

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1.微波罐安装到萃取仪上，同时将搅拌安装好，接冷凝管，开回流水。

2.准备就绪，接通电源，开高压开关，设置温度84℃，微波功率600W，保温时间10min。

3.将微波罐取出，提取液离心，4800r，10min，抽滤。

4.固液分离，沉淀转移回微波罐，进行二次提取，参数设置和一次提取相同。

注意事项：

萃取结束后一定要先冷凝，待冷凝后再取出微波罐。

五、思考题

（一）预习

1、说明茶多酚的溶解性能及对热的稳定性。

茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末，易溶于温水（40℃一80℃）和含水乙醇中；

稳定性极强，在PH值4-8、250℃左右的环境中，1.5个小时内均能保持稳定，在三价铁离子下易分解。

2、简述微波萃取技术的基本原理。

3、简述微波萃取的基本操作过程和注意事项。

选取要萃取的原料装入微波罐中，将微波罐安装到萃取仪上，用夹子固定牢靠；

安装好搅拌机，接通回流水，设定微波参数开始萃取。

4、实验结果和讨论

1、计算出最适萃取条件下茶多酚的收率。

答：

旋蒸后所得提取液体积为335mL，实验Ⅳ中测得提取液中茶多酚浓度为0.159mg/mL，所以提取液中茶多酚总含量53.265mg，茶多酚收率为所得茶多酚质量比茶叶总质量，即53.265mg/100g=0.053%

2、根据收率，比较微波萃取和常规萃取效果的差异。

微波萃取效率高、纯度高、能耗小、操作费用低，符合环境保护要求。

可广泛用于中草药、香料、保健食品、食品、化妆品、茶饮料、调味料、果胶、高粘度壳聚糖等行业。

目前在我国微波萃取已经用于多项中草药的浸取生产线之中，如葛根、茶叶、银杏等。

微波萃取已列为我国二十一世纪食品加工和中药制药现代化推广技术之一。

某中药研究机构的科研工作者，已经用微波萃取方法处理上百种中药。

无论是萃取速度、萃取效率还是萃取质量均比常规工艺优越得多。

微波萃取技术与现有其他的萃取技术相比有明显的优势。

化学溶剂萃取法耗能大，耗材多，耗时长，提取效率低，工业污染量大。

超临界流体提取在提取效率上大有提高，但所需装备复杂，溶剂选择范围窄，要高压力容器和高压泵，建立大规模提取生产线难度大，成本高。

实验二超声波辅助提取茶多酚实验

1、通过茶多酚的提取，了解超声波萃取仪的使用方法及原理。

2、比较其与索氏提取法与微波辅助提取茶多酚的优缺点。

利用40/2KHZ的超音频电能，超声波换能器将高频振荡电讯号转换成高频机械振荡，以纵波的形式在清洗液中辐射。

在辐射波扩张的半波期间，清洗液的致密性破坏并形成无数直径为50-500um的气泡。

这种气泡中充满着溶液蒸汽。

在压缩的半波期间，气泡迅速闭合，会产生上百MPa的局部液污垢被爆裂、剥落及撞击，这种现象被称为“空化”效应。

在“空化”效应的连续作用于工件表面或隐蔽出的同时，在超声的作用下，清洗液的渗透作用加强;

脉动搅拌加剧；

溶解，分散和乳化作用加强；

这种空化侵蚀作用就是超声波清洗的基本原理。

CLA-1000型系列超声波清洗机为单槽式，使用碱性或弱性水基溶剂作为清洗剂，适用于可作生物和植物细胞破碎；

可做生物和植物有效成分萃取:

可作中草药有效成分的低温提取。

（一）器材

超声清洗机、圆底烧瓶、烧杯、量筒和抽滤瓶、铁架台等。

（二）试剂

茶叶、乙醇、去离子水、滤纸等。

（一）开机前准备

1、检查清洗机是否安装平稳妥善，机壳接地是否可靠。

2、将电器控制面板上的所有的开关置于“关”的位置，检查电源是否合乎要求，电源指示灯是否亮。

3、关闭清洗机侧面的排液球阀。

4、注入清洗液，待清洗件完全浸入清洗液后，液面至清洗槽50mm左右。

（二）操作说明

1、接通电源，将温度控制调节器旋至84℃。

2、当达到设定温度后，相应指示灯自动熄灭。

3、称取100g茶叶，60%的乙醇水溶液，固液比1:

12，于2000ml的圆底烧瓶内，浸泡10min，放入超声波清洗机中，用铁架台固定。

4、打开超声波发生器上超声波开关，相应指示灯亮，超声波作用30min。

5、萃取液离心，过滤，二次提取，合并滤液，紫外吸光光度法检测其浓度。

6、清洗机停止工作前，先关掉超声波开关，将温度控制调节器旋至0℃，再切断电源。

1、简述用超声波清洗器提取茶多酚的原理。

超声波在溶液中产生“空化”效应，在“空化”效应的连续作用于工件表面或隐蔽处的同时，在超声的作用下，清洗液的渗透作用加强;

2、简述超声波萃取的基本操作过程和注意事项。

打开电源加热升温到实验温度，将茶叶装入圆底烧瓶中放入超声清洗机中，打开超声发生器电源，作用半小时。

清洗机停止工作前，先关掉超声波开关，将温度控制调节器旋至0℃，再切断电源。

（三）实验结果和讨论

1、将超声波萃取的操作过程及结果和微波提取作比较，并列出其优缺点。

超声波、微波辅助提取都能大大缩短提取时间，避免因提取时间过长而造成的氧化损伤，提取率高，节约能耗。

两者相比，微波辅助提取使用的容剂更少，提取时间更短，提取效果显著。

2、将试验样品进行比色测定，计算分析结果。

旋蒸后所得提取液体积为335mL，实验Ⅳ中测得提取液中茶多酚浓度为0.159mg/mL，所以提取液中茶多酚总含量53.265mg，茶多酚收率为所得茶多酚质量比茶叶总质量，即53.265mg/100g=0.053%

3、分析引起实验误差的原因。

实验三索氏提取茶叶中茶多酚

1、掌握索氏提取器的使用方法及原理。

2、比较索氏提取法与微波辅助提取茶多酚的优缺点。

“相似相溶”原理：

在实验室多采用脂肪提取器（索氏提取器）来提取，脂肪提取器就是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶剂，萃取效率也高。

萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触面积。

然后将固体物质放在滤纸套内，置于索氏提取器中，提取器的下端和盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。

加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸汽通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处是，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。

1、器材

索氏提取器（又称脂肪提取器），加热套，烧杯，量筒和容量瓶等。

2、试剂

茶叶、乙醇、去离子水、滤纸、沸石等。

1、用滤纸制作圆柱状滤纸筒，称取10g茶叶，装入滤纸筒中，将开口端折叠封住，放入提取筒中。

将250ml圆底烧瓶安装于电热套上，放入2粒沸石，量取80%乙醇200ml，从提取筒中倒入烧瓶，安装好索氏提取装置，打开电源，加热回流2小时。

2、实验时能够观察到，随着回流的进行，当提取筒中回流下的乙醇液的液面稍高于索氏提取器的虹吸管顶端时，提取筒中的乙醇液发生虹吸并全部回流到烧瓶内，然后再次回流，虹吸，记录虹吸次数。

虹吸5-6次后，当提取筒中提取液颜色变得很浅时，说明被提取物已大部分被提取，停止加热，移去加热套，冷却提取液。

3、拆除索氏提取器（若提取筒中仍有少量提取液，倾斜使其全部流到圆底烧瓶中），安装紧贴器壁又要能方便放置。

1、简述用索氏提取器提取茶多酚的原理

索氏提取器提取茶多酚利用了茶多酚易溶于乙醇的“相似相溶”原理,索氏提取器就是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取。

萃取前先将茶叶放在滤纸套内，置于索氏提取器中，提取器的下端和盛有乙醇的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。

加热圆底烧瓶，使乙醇沸腾，蒸汽通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，乙醇和茶叶接触进行萃取，当乙醇面超过虹吸管的最高处时，含有茶多酚的乙醇虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分茶多酚，如此重复，使固体物质不断为纯乙醇所萃取，将萃取出的茶多酚富集在烧瓶中。

（二）实验结果和讨论

1、将索氏提取的操作过程及结果和微波提取作比较，并列出其优缺点。

微波提取热效率高、升温快速而均匀，显著缩短了萃取时间，提高了萃取效果。

选择性强、重现性好、有机溶剂的消耗量小等诸多优点。

索氏提取残留量高、能耗大且操作繁琐，耗时长。

2、将试样样品进行比色测定，计算分析结果。

实验四酒石酸亚铁分光光度计法测定茶多酚含量

一、实验目的和要求

1、掌握分光光度计的使用方法和原理。

2、学会用酒石酸亚铁分光光度计法测定茶多酚含量的具体方法。

二、实验原理

茶多酚主要成分是表儿茶素和表没食子儿茶素类等。

儿茶素结构中的羟基在苯核上的位置既有邻苯二酚基，又有连苯三酚基，还有没食子酸形成的酯形结合物。

利用酒石酸亚铁为显色剂，与茶多酚中的邻位羟基和连位羟基功能团作用，形成蓝紫色络合物（对间位羟基和单羟基不显色），在一定的浓度下，复合物的吸光度值与茶多酚浓度成正比，故可采用比色法测定。

利用没食子酸丙酯具有邻位酚羟基和连位酚羟基，又具有羟丙酯基的特点，能代表儿茶多素多种酚类的实际情况，故可用它为标准品，在pH7.5，波长540nm，1cm比色皿条件下，与显色剂酒石酸亚铁作用，制作标准曲线。

1mg没食子酸丙酯的吸光度相当于1.5mg茶多酚的吸光度值，换算系数为1.5。

三、实验器材与试剂

1、器材

分光光度计（可见光），比色皿，酸度计，烧杯，量筒和容量瓶等

2、试剂

没食子酸丙酯，茶多酚纯品（含量大于等于98%），硫酸亚铁，酒石酸钾钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾等。

四、操作方法

1、溶液配制

（1）酒石酸亚铁溶液的配制

准确称取0.1g硫酸亚铁（

）和0.5g酒石酸钾钠将其混合，用蒸馏水溶解后，移入100ml的容量瓶中并稀释至刻度，摇匀。

（2）pH7.5磷酸盐缓冲与的制备

磷酸氢二钠：

准确称取分析纯磷酸氢二钠2.969g，用蒸馏水溶解，移入250ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

该液成为A液。

磷酸二氢钾：

准确称取分析纯磷酸二氢钾2.2695g，用蒸馏水溶解，移入250ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

该液成为B液。

取A液85ml，B液15ml混匀，即为pH7.5缓冲液。

2、标准曲线制作

3、样品测定

吸取1ml的样品液稀释至10ml，取1ml于25ml的容量瓶中，加入4ml蒸馏水，再加入酒石酸亚铁溶液5ml，用pH为7.5的磷酸缓冲液溶液稀释至刻度，摇匀，在549nm波长处，用1cm比色皿比色，测量吸光度A。

根据标准曲线，算出没食子酸丙酯绝对量（mg），并乘以换算系数1.5，然后求得茶多酚的含量（mg/ml）。

若直接用茶多酚纯品制作标准曲线，则不需乘换算系数1.5。

五、思考题

1、预习

简述用分光光度计测定茶多酚含量的原理

分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：

当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。

但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。

2、实验结果和讨论

（1）将比色测定的操作过程及结果列成表格，做标准曲线图，并做线性回归，求出线性方程。

（已给出）

（2）将实验

和II的样品进行比色测定，计算分析结果。

样品

吸光度值

没食子丙酯绝对量（mg/mL）

茶多酚含量（mg/mL）

实验Ⅰ

1.244

0.106

0.159

实验Ⅱ

0.476

0.041

0.061

（3）分析引起实验误差的原因。

实验五大孔树脂吸附法精制茶多酚

1、了解大孔吸附树脂的结构特点和吸附机理。

2、掌握大孔吸附树脂分离提纯茶多酚的操作方法。

大孔吸附树脂在合成的过程中没用引入离子交换功能基团，只有多孔的骨架，简称大孔吸附树脂，又称大孔吸附剂或吸附树脂。

大孔吸附树脂是一种非离子型共聚物。

它能够借助范德华分子引力从溶液中吸附各种有机物质。

吸附树脂的吸附能力与树脂的化学结构和物理性质及溶液的性质有关。

由于树脂的化学结构不同，可分为非极性、中等极性和极性三大类。

根据类似物容易吸附类似物的原则，一般非极性树脂适宜从极性溶剂（如水）中吸附非极性物质。

相反，极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质。

而中等极性的吸附剂则对上述两种情况都有吸附能力。

非极性吸附剂从极性溶剂中吸附时，溶质分子的憎水性部分先被吸附，亲水性部分在水相中定向排列。

相反，中等极性吸附剂从非极性溶剂中吸附时，溶质分子以亲水性部分吸着在吸附剂上；

而当它从极性溶剂中吸附时，则可同时吸附溶质分子和非极性部分。

三、实验器材和试剂

层析柱，恒流泵，旋转式真空蒸发泵，试管，烧杯和量筒等。

HZ-818树脂（华东理工大学华震科技有限公司），乙醇等。

1、树脂装柱

称取预处理过的湿树脂20g左右，加入去离子水润湿，湿法装柱：

先在玻璃柱中加入少量的去离子水，然后将树脂沿着管壁缓缓倒入（一次全部倒入为宜）,待树脂沉降结束后，旋紧顶盖，注意不要产生气泡，通入去离子水。

测量树脂床层高度，计算树脂床层体积（BV）。

控制流速为2~2.5BV/h（约1ml/min），洗脱30min左右，使床层达到稳定。

2、上样吸附

取微波萃取后的滤液，浓缩回收乙醇后，4800r/min，离心10min，上清液真空抽滤，量取一定量滤液于料液烧杯中（约200ml左右），取样分析测定上样液中茶多酚的含量。

将蠕动泵的进口端放入料液烧杯中，开始上样吸附，控制流速为2~2.5BV/h（约1ml/min），流出液用量筒收集并不断取样分析，直至流出液中茶多酚含量与进口料液基本相等，说明树脂已经达到饱和，即可停止吸附。

通完料液后，再通入约2倍床层体积的去离子水洗涤树脂，除去未吸附的茶多酚，流速相同，流出液收集在同一支试管中。

最后，量流出液的总体积，混合均匀，分析茶多酚含量。

同时，确定通入柱的料液体积。

按下式求树脂的吸附容量（Q）：

式中：

V1和U1——分别为通入柱的滤液体积（ml）和茶多酚含量（mg/ml）

V2和U2——分别为流出合并液的体积（ml）和茶多酚含量（mg/ml）

m——柱中湿树脂的质量（g）

3、洗脱

上样结束后，按如下步骤进行洗脱：

1通入5%乙醇洗涤树脂，以除去杂质（如咖啡因等），用量为树脂床层体积的2-3倍，流速同上，流出液弃去。

2换用70%乙醇洗脱茶多酚，控制流速为1.2BV/h（约0.5ml/min），用量为树脂床层体积的5-6倍，收集此部分洗脱液。

量取体积并取样分析茶多酚含量。

计算洗脱收率（D）:

式中V3和U3——分别为洗脱液收集液的体积（ml）和茶多酚含量（g/ml）

简述大孔树脂的吸附机制，为什么用乙醇可以洗脱茶多酚？

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物即非极性或极性较弱的物质，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。

树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力,通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作,使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。

茶多酚可溶于乙醇，故可用乙醇将茶多酚洗脱。

1、求树脂的吸附容量和洗脱收率。

V1=250mLU1=1.018*1.5/11.703=0.13mg/mL

V2=154mLU2=0.403*1.5/11.703=0.05mg/mL

V3=112mLU3=0.182*1.5/11.703=0.02mg/mL

吸附流量（mg/g湿树脂）=（250*0.13-154*0.05）/20=1.24（mg/g湿树脂）

洗脱收率=112*0.02/（250*0.13-154*0.05）*100%=9.03%

2、求干成品中茶多酚的含量（mg/mg），分析其纯度。

3、考虑并分析分离纯化过程中洗脱收率与纯度间的关系。

实验六喷雾干燥试验（演示实验）

1、掌握喷雾干燥的使用方法及原理

2、学会操作的具体方法

本世纪发展起来的喷雾干燥工艺已经成为多种产品干燥的最优方法，其应用范围还在不断扩大。

喷雾干燥机是完成喷雾干燥工艺的必备专用设备，该设备是新型冷干燥工艺设备，它可使乳浊品、悬浊液、糊状液的有机物料、无机物料、生化制品等转变为粒度均匀的制品。

具有速度快、效率高、产品质量好的特点。

适用于石油、建筑、冶金、食品、医药、生化等各个行业。

可加工产品类别有：

聚合物和树脂制品、染料、色料、陶瓷、玻璃、除锈剂、杀菌剂、碳水化合物、奶制品、蛋类、食品和植物提炼品、药品及生化制品、洗涤剂和表面活性剂、有机制品、无机制品等。

本实验采用二流喷嘴雾化和并流干燥方式。

液体通道位于喷嘴中间，孔径0.5，液体通道外为气体通道，高压气体将液体雾化成微小雾滴，达到雾化目的。

在干燥室中，热空气与雾滴接触，雾滴水分迅速蒸发而成为干燥颗粒。

三、实验仪器与试剂

WP-1.5微型喷雾干燥机，空压机，水

四、实验操作步骤

实验七用超滤技术浓缩和分离牛血清蛋白BSA

在生物工程分离技术中，超滤法是近年来才发展起来的新型分离技术。

本实验利用小型超滤设备（板式膜）对牛血清蛋白粗品进行分离和浓缩，其中包括三部分实验内容：

制备超滤用的BSA溶液。

进行超滤性能的研究，包括水通量和截留率的测定，制作超滤速度随透出液体变化的曲线，并进行膜的清洗处理。

用紫外分光光度计法测定BSA浓度。

通过实验可以加深对膜分离技术理论的理解，并对该分离技术的过程和理论有所了解。

1、了解超滤技术的基本原理和操作方法

2、掌握超滤膜水通量和截留率的测定方法

3、以BSA为实验对象，研究超滤过程中的超滤速度随透出液体积变化的规律

水通量是膜的重要指标，表示纯水在一定条件下超滤时，透过水的速度，即单位时间单位膜面积透过水的体积，水通量

按式

（1）计算：

（1）

V——透过膜的水量（

）

t——透水时间（h）

S——膜的有效面积（

超滤过程中，比膜孔径大的溶质分子被截留，小的分子被透过。

超滤膜对某溶质的截留能力用截留率R%来表征，在间歇式操作中可按式

（2）计算整个超过程中的平均截留率：

（2）

分别为渗透前后溶液的浓度

超滤过程中，由于大分子溶质在膜表面的积聚，形成由膜表面到主体溶液之间的浓度梯度，产生浓差极化现象，使超滤速度降低。

在操作压力

恒定的条件下，随透过液体积V增大，超滤速度不断降低。

牛血清白蛋白（BSA）为球形蛋白，分子量为68000（有文献中说是66000或67000），等电点为4.7。

此蛋白为一个单氨基酸链，通过17个二硫键形成9个双环。

白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。

血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用。

在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。

超滤设备和膜组件，天枰，秒表，量筒和烧杯等。

BSA样品，去离子水。

1、制备BSA溶液

取一定量的BSA样品，用去离子水配成浓度为0.1mg/ml的溶液250ml，备用。

2、膜的冲洗和水通量的测定

（1）采用截断分子量为

的PEI超滤膜进行超滤，记录膜的有效截面积。

将膜组件安装到超滤设备中。

（2）冲洗膜

量取一定量去离子水放入料液烧杯中，改变横流泵的转速和料液出口阀门（止水夹），调节压力表至一定的压力（0.2MPa左右），将膜冲洗干净。

（3）水通量测定

量取一定量去离子水放入烧杯中，改变蠕动泵的转速和料液出口阀门，在实验过程中压力应保持恒定。

测量水通量时，用量筒收集透出的水，并立即用秒表记时间，测定一定量流出液体积（每次测15ml）所需的时间t（min），按公式

（1）计算水通量

，重复测定2-3次，取平均值。

3、超滤速度J随透出液体积V而变化的规律

量取一定量BSA溶液（150ml）放入烧杯中，改变蠕动泵的转速和料液出口阀门，调节压力表至一定压力（实验过程中取

左右），并保持恒定。

超滤过程中，用一个大量筒收集透出液。

同时，每隔一定量透出液（5ml），另拿一个小量筒按上述相同方法测J，记录一定量透出液的累积体积V，即得到一个J-V的实验数据。

测完后，将小量筒中透出液合并入大量筒的透出液中，继续超滤，达到预定量的透出液后，再重复上述操作，共进行5次左右。

当透出液体积V约为料液的3/4时，停止超滤。

将数据列表，并以J为纵坐标，V为