单克隆抗体的研制最详细步骤Word下载.docx

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在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：

超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（—70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等.其需要的主要器械包括：

100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管，试管,滴管（弯头、直头）,平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板,可调微量加样器（~50ul，～200ul，～1000ul）,弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。

此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备,依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。

淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括:

动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等,图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。

1、动物免疫

（1）抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。

因此,免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。

一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定，提纯时易变性,或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。

检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性.

（2）免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。

因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。

但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。

种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。

就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。

（3）免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。

因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等.没有一个免疫程序能适用于各种抗原.现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。

表6—1列举了目前常用的免疫程序.免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼.最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分.在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞

融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。

笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。

因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。

已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间,一般免疫3天后即可融合。

2、细胞融合

（1）主要试剂的配制

a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI—1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0。

22um），分装，4℃保存。

？

不完全RPMI-1640培养基：

RPMI—1640培养基原液96ml

100×

L。

G.溶液1ml

双抗溶液1ml

7。

5%NaHCO3溶液1—2ml

HEPES溶液1ml

不完全DMEM培养基：

DMEM13.37g

超纯水或四蒸水980ml

NaHCO33.7g

双抗溶液10ml

L.G。

溶液10ml

用1NHCl调试PH至7。

2-7。

4，过滤除菌，分装4℃保存。

?

完全RPMI—1640或DMEM培养基：

不完全RPMI—1640或DMEM培养基80ml

小牛血清15—20ml

用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养.

HT培养基：

完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml

HT贮存液1ml

HAT培养基：

完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml

A贮存液1ml

b、氨基喋呤（A）贮存液（100×

，4×

10—5mol/L）:

称取1.76mg氨基喋呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。

过滤除菌,分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×

，H：

10—2mol/L，T：

1.6×

10-3mol/L）：

称取136。

1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine,MW136。

1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine,MW242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45—50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶）,—20℃冻存。

用前可置37℃加温助溶。

d、L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×

，0.2mol/L）：

称取2。

92gL-谷氨酰胺（L—glutamine,MW146。

15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），—20℃冻存。

e、青、链霉素（双抗）溶液（100×

）：

取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4—5ml/瓶）,—20℃冻存。

f、7。

5％NaHCO3溶液:

称取分析纯NaHCO37.5g,溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4—5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。

g、HEPES溶液（1mol/L）:

称取23。

83gHEPES（N—2-Hydroxyethylpiperazine—N，—2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基哌嗪—N,—2—乙基磺酸，MW238。

3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存.

h、8-氮鸟嘌呤贮存液（100×

）:

称取200mg8-氮鸟嘌呤（8—azaguanine，MW152。

1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；

分装小瓶，-20℃冻存。

使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。

i、50％PEG:

称取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，盖紧，60—80℃水浴融化，0。

6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧,8磅高压蒸汽15分钟,-20℃存放备用。

临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7。

5％NaHCO3调PH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。

⑵髓瘤细胞的准备

融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。

目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。

冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。

在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。

1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。

典型的倍增时间为14—16小时。

骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：

a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2—3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。

b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。

c、1000r/min离心5—10分钟，弃去上清。

d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。

然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基,混匀。

e、取骨髓瘤细胞悬液，加0。

4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。

细胞计数时,取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中,混匀，用血球计数板计数。

计算细胞数目的公式为：

每毫升细胞数=4个大方格细胞数×

105/4；

或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×

106/2

⑶脾淋巴细胞的准备

取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。

同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于75％酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏,换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。

将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。

用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。

为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。

收获脾细胞悬液，1000r/min离心5—10分钟,用不完全培养基离心洗涤1-2次,然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀,取上述悬液,加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。

通常每只小鼠可得1×

108-2.5×

108个脾细胞,每只大鼠脾脏可得5×

108-10×

108脾细胞.

⑷饲养细胞（Feedercells）的制备

在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞.饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；

也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。

其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍.其制备方法如下：

按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。

用酒精棉球擦拭腹膜消毒。

用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。

右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液.1000r/min离心5—10分钟,弃上清。

先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×

105/ml，备用。

通常对巨噬细胞来说,96孔培养板每孔需2×

104个细胞,24孔板每孔需105细胞。

每只小鼠可得3-5×

106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞.也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。

做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0。

1ml（相当于2滴），然后置37℃6％CO2的培养箱中培养。

⑸细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。

A、将1×

108脾细胞与2×

107-5×

107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml,充分混匀。

B、1000r/min离心5—10分钟，将上清尽量吸净.

C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；

置40℃水浴中预热。

D、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50%PEG（PH8。

0）1ml，边加边轻轻搅拌。

E、用10ml吸管在90秒内加20—30ml预热至37℃的不完全培养基；

20-37℃静置10分钟。

F、1000r/min5分钟；

弃去上清。

G、加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml.

H、分装96孔细胞培养板，每孔0.10—0。

15ml；

分装24孔板，每孔1。

0—1。

5ml；

然后将培养板置37℃，6%CO2培养箱内培养.

I、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。

J、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；

（第14天后可用普通完全培养基）.

L、经常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

3、杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。

抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定.但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点.因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍.所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。

一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题.另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。

如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。

另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：

1,最好为100：

1。

另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。

结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出.如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法.

下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：

⑴免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。

由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。

A、器材和试剂

a。

包被缓冲液：

碳酸盐缓冲液:

取0.2mol/LNa2CO38ml,0.2mol/LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。

Tris—HCl缓冲液（PH8.0,0。

02mol/L）：

取0.1mol/LTris100ml，0。

1mol/LHCl58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。

b.洗涤缓冲液（PH7。

2的PBS）:

KH2PO40.2g，KCl0。

2g,Na2HPO4？

12H2O2。

9g，NaCl8.0g,Tween—200.5ml,加蒸馏水至1000ml。

c.稀释液和封闭液：

牛血清白蛋白（BSA）0。

1g，加洗涤液至100ml；

或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。

d。

酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：

取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。

e.底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：

取0。

2mol/LNa2HPO425。

7ml，0。

1ml/L柠檬酸24。

3ml，再加50ml蒸馏水。

柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多.

f。

底物使用液：

OPD底物使用液（测490nm的OD值）：

OPD5mg，底物缓冲液10ml，3％H2O20。

15ml。

TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：

TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1％H2O225ul.

ABTS底物使用液（测410nm的OD值）:

ABTS0.5mg，底物缓冲液1ml,3％H2O22ul。

g.抗体对照:

以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。

h.抗原：

可溶性抗原：

尽量纯化，以获得高特异性。

病毒感染的传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

i.酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂.

j.细胞固定液：

—20℃丙酮;

或丙酮-甲醛固定液：

Na2HPO4100mg,KH2PO4500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；

或丙酮-甲醛溶液（1;

1）；

或—20℃甲醇。

k.聚苯乙烯微孔板:

40孔、96孔、或条孔；

硬板或软板均可使用。

l。

酶联免疫阅读仪；

或光镜。

m.吸管、加样器及水浴箱、离心机等。

B、可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）

纯化抗原用包被液稀释至1—20ug/ml。

b。

以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

c。

弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟,拍干。

每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时;

该步骤对于一些抗原，可省略。

e。

洗涤液洗3次；

此时包被板可-20℃或4℃保存备用.

f.每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照和空白对照；

37℃孵育1—2小时；

洗涤，拍干。

g。

加酶标第二抗体，每孔50—100ul，37℃孵育1-2小时,洗涤，拍干。

h。

加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50—100ul，37℃10—30分钟。

i。

以2mol/LH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

j.结果判定：

以P/N?

2。

1，或P?

N+3D为阳性。

若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

C、全菌抗原的ELISAS

a.新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×

108个/ml.必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。

每孔中加100ul5％戊二醛溶液（0。

1mol/LNaHCO395ml+25％戊二醛溶液5ml）,37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；

加上述细菌悬液50ul/孔；

37—56℃烘干；

每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃2小时封闭。

c.步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃—56℃烘干,然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；

d.洗涤液洗3次；

此时包被板可在—20℃或4℃保存备用。

e.以下步骤同上法。

D、用全细胞抗原的ELISA

a.按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。

b.淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新