保健食品中大豆异黄酮的检验方法Word格式文档下载.docx
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美国C1ifbar公司开发出添加了大豆异黄酮的运动饮料，美国加州Imagine食品公司开发含大豆异黄酮、蛋白质、碳水化合物、23种维生素和矿物质的能量饮料。
不同的产品，大豆异黄酮的含量也不同，目前保健品市场上片剂一般每片（500mg）约含大豆异黄酮几十毫克，胶囊每粒含大豆异黄酮几十毫克，口服液饮料每一百毫升含大豆异黄酮几十到上百毫克，大豆异黄酮粉末含大豆异黄酮为每克一百到几百毫克。
国内生产含大豆异黄酮的保健食品厂家很多，有的产品标示的大豆异黄酮含量与实际含量差别很大，实际含量远小于标示含量，保健品市场有待于进一步规范。
为了保障消费者的利益，也为企业提供更好的技术支持，因此建立一种相对统一、简便适用、经济的测定保健食品中大豆异黄酮含量的检测方法是很必要的。
3．国内外检测方法研究进展
作为一种天然有效的抗氧化剂，大豆异黄酮越来越受到重视，对其功能性研究，生物活性研究以及产品开发也是越来越广泛。
但是纯净的大豆异黄酮难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、等有机溶剂。
大豆异黄酮的性质限制了它在饮料等食品体系中的应用，但是随着保健品市场的逐渐升温，各种声称含有大豆异黄酮成分的保健品和食品越来越多，但是国家并未制定统一的检测标准，国内仅有农业部于2007年2月1日开始实施的行业标准NY/T1252-2006《大豆异黄酮》，它主要针对大豆异黄酮产品。
卫生部出版的《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中有用HPLC法测定染料木素和大豆黄素的方法。
虽然许多学者建立了基于不同系统分析大豆异黄酮含量的方法，如紫外分光光度法，该方法简便，但特异性较差；
薄层扫描法（TLCS）操作简便。
分离效果较好，但显色剂用量难于控制，人为误差较大；
气相色谱法（GC）进样量少、高敏感性、高选择性、但在测定大豆黄素和染料木素时需要制备衍生物，样品制备步骤较多，耗时长；
毛细管电泳法（CE）速度快，选择性高，仪器价格昂贵，难以普及；
高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）具有无可比拟的优越性，易于定性和定量但因仪器价格昂贵，普及困难；
高效液相色谱法（HPLC）测定样品范围广，样品制备步骤少，成本低，分离效率高，灵敏度好，测定结果准确，而且可有多种检测器供选择。
所以本课题组通过查询资料和调研，选择高效液相色谱（HPLC）法测定保健食品中大豆异黄酮的含量。
4．实验部分
4.1色谱条件的选择
流动相的选择：
参照国内外文献资料，选择了乙睛-水作为流动相，比较了在相同的进样量情况下，不同pH值（pH=，，，）的流动相对大豆异黄酮分离效果的影响。
在pH较高时，大豆黄素、黄豆黄素和染料木素的峰有拖尾现象，在pH值时峰型较好，拖尾现象得到改善。
通过上述试验的比较，最终确定色谱流动相为：
乙腈-水（）；
梯度洗脱：
12%～18%乙腈，0～10min；
18%～24%乙腈,10～23min；
24%～30%乙腈,23～30min；
30%乙腈,30～50min，80%乙腈，50～55min。
此条件下，保留时间和峰面积比较，有较好的稳定性和重现性。
一次开机，连续运转5天，以下六个分别为第21，38，49，107，123，124针所进标样的保留时间，见表1。
表格1六次进样保留时间比较
单位：
min
名称次数
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD（%）
大豆苷
黄豆苷
染料木苷
大豆黄素
黄豆黄素
染料木素
检测波长的选择：
对以大豆苷、黄豆苷、染料木苷、大豆黄素、黄豆黄素和染料木素进行波长扫描，波长范围：
220nm～450nm，光谱图见附页1。
通过光谱图比较，这六种物质在260nm有最大吸收，因此选定260nm作为检测波长。
标准工作曲线和线性范围
配制不同浓度的标准使用液在上述色谱条件下进行HPLC测定。
线性方程和相关系数
见表2和附页2。
表格2标准曲线数据列表
样品名称
浓度（μg/mL）
峰面积
线性方程
相关系数
Y=+
由表2可知，本方法的标准工作曲线线性范围较宽，0~120μg/mL线性良好。
4.2样品处理
4.2.1提取溶剂的选择
大豆异黄酮难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，参照国内外相关资料，选择了80%甲醇提取保健食品中的大豆异黄酮成分，80%的甲醇提取的样品色谱图见附页3。
保健食品片剂和粉末一般以淀粉和糊精作为填充剂，80%的甲醇能够使淀粉和糊精沉淀，另外能够有效提取大豆异黄酮成分；
软胶囊含油脂，用80%的甲醇作为萃取剂，一方面大大降低了油脂的溶解度，延长色谱柱的使用寿命，也可以有效提取大豆异黄酮。
保健饮料中的大豆异黄酮可溶于水，可以直接用80%甲醇提取。
4.2.2超声时间的选择
保健食品中组分复杂，含有淀粉、糊精、油脂、蛋白等各种成分，能够包容大豆异黄酮有效成分，通过超声萃取能够快速有效的提取。
本实验选择0min，10min，20min，30min，40min进行超声处理。
结果见图1。
图1超声时间对提取效果的影响
从上图可以看出，超声时间对软胶囊提取影响较明显，超声波能够使软胶囊中油状物破乳，大豆异黄酮成分能够更加快速被甲醇萃取出来，但是随着超声时间的延长，提取量没有明显增加，选定超声时间为20min。
硬胶囊（粉剂），粉剂为粉末状物质，它能够较好的分散于80%的甲醇中，使得其中的大豆异黄酮组分比较容易被提取，所以超声20min已能够完全提取。
4.3本方法的检出限
本方法的检出限：
进样量为10μL时，大豆苷（daidzin）、黄豆苷（glycitin）和染料木苷（genistin）、大豆黄素（daidein）、黄豆黄素（glycitein）和染料木素（genistein）的最低检出浓度均为：
μg/mL，最低检出量如下:
以大豆异黄酮为主要功能性成分的片剂、胶囊及大豆异黄酮粉末g,口服液的最低检出量为:
mL，保健饮料最低检出量为:
mL。
4.4本方法的重复性和精密度
按照本方法，选择五种代表性的大豆异黄酮保健食品进行日内重复性测定，结果表明本方法精密度好，准确度高，操作简便，适合推广应用。
部分结果见下表。
表中，以大豆异黄酮总量计mg/g，饮料的单位为μg/mL。
表格3日内重复性
单位：
mg/g
次数
名称
胶囊
粉末
片剂
饮料
表格4样品中六种大豆异黄酮成分的重复性
次数名称
通过表4可以看出，六种大豆异黄酮日内重复性较好，精密度较高。
按照本检验方法对样品进行日间重复性测定：
间隔两天，共测定三次，部分实验结果见表5
表格5日间重复性
名称
4.5本方法的准确度
按照本检验方法对样品饮料、片剂、胶囊、口服液的加标回收实验，回收率见表6。
表格6饮料（空白）加标回收
实际测定均值（μg/mL）
加标量（μg/mL）
平均回收率（%）
95
99
97
98
103
101
100
96
104
表格7片剂（空白）加标
实际测定均值（mg/g）
加标量（mg/g）
106
表格8胶囊加标回收
实际测定值（mg/g）
样品本底值（mg/g）
回收率（%）
102
染料
木苷
大豆
黄素
黄豆
木素
94
表格9口服液加标回收
实际测定值（mg/mL）
样品本底（mg/mL）
加标（mg/mL）
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