辽宁石油化工大学环境与生物工程学院Word格式.docx
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3
2/4-9/4
2.植物细胞培养和次生代谢物的生产
4
9/4-16/4
3植物细胞原生质体制备与融合
4.单倍体植物的诱发与利用
5
16/4-23/4
5人工种子的研制
6
23/4-30/4
三动物细胞工程
1.细胞培养的条件
2原代细胞的培养与建系
7
7/5-14/5
3.细胞组织培养
4.细胞融台和单抗的杂交瘤技术
5.细胞拆合
8
14/5-21/5
复习考试
绪论
【课时安排】
1.1细胞工程在生物技术领域中的地位1学时
1.2细胞工程的发展1学时
总计2学时
【掌握内容】
1.基本概念：
生物技术定义、细胞工程。
2.细胞工程的发展。
【了解内容】
1.了解细胞工程与现代生物技术的关系；
了解细胞工程的发展与相关学科的联系；
了解细胞工程在现代世界经济中的潜力.
2.生物技术的内涵。
3.生物技术对经济社会发展的影响。
【教学难点】
1.生物技术对经济社会发展的影响。
2.。
基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程含义及相互关系。
【教学目标】
1.掌握生物技术定义、细胞工程基本概念。
2.能对几对重要概念进行辨析。
3.能了解现代生物技术及细胞工程发展历史。
第一节细胞工程在生物技术领域中的地位
生物技术被世界各国视为一项高新技术。
细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。
亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，及通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。
一、生物技术概述
1.生物技术定义:
是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。
解释先进的工程技术手段、改造生物体、生物原料、为人类生产出所需的产品、达到某种目的。
2.生物技术的内涵主要是：
1）运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；
2）工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；
3）模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；
4）发展相应的科学理论与工程技术。
主要技术范畴包括：
基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。
3.现代生物技术特征：
多学科性；
商业性；
规模化。
4.生物技术发展历程。
4.1传统生物技术的发展
4.2现代生物技术的发展
5.生物技术涉及的学科
它以包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎所有生物科学的次级学科为支撑，又结合了诸如化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学等生物学领域之外的尖端基础学科，从而形成一门多学科互相渗透的综合性学科.
概括地说，生物技术相关的行业可分为七大类型（表1-2）。
6.生物技术对经济社会发展的影响
6．1改善农业生产、解决食品短缺
6．1．1提高农作物产量及其品质
（1）培育抗逆的作物优良品系
（2）植物种苗的工厂化生产
（3）提高粮食品质
（4）生物固氮，减少化肥使用量
6．1．2发展畜牧业生产
6．2提高生命质量，延长人类寿命
医药生物技术是生物技术领域中最活跃，产业发展最迅速，效益最显著的领域。
其投资比例（图1－3）及产品市场（表1-3）均占生物技术领域的首位。
6.2．1开发制造奇特而又贵重的新型药品
6．2．2疾病的预防和诊断
6．2．3基因治疗
6．2．4人类基因组计划（HGP）
6．3．3解决能源危机、治理环境污染
6．3．3．1解决能源危机
6．3．3．2环境保护
6．3．4制造工业原料、生产贵重金属
6．3．4．1制造工业原料
6．3．4．2生产贵重金属
二、细胞工程的概念及研究范畴
1.细胞工程（cellengineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞整体水平和细胞器水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的一门综合性科学技术。
2.研究范畴根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。
3.细胞工程的优势：
避免了分离、提纯、煎切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。
第二节细胞工程的发展
一、动物物细胞工程的发展
1．融合现象的发现
2.动物组织细胞培养技术的建立
3.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生
4.动物克隆技术的建立
二、植物细胞工程的发展
1．探索阶段
2．培养技术建立阶段
3．应用研究阶段
三细胞工程的基础知识与基本技术
1基础知识
1.1细胞的特性
1.1.1培养细胞的形态
1.1.2培养细胞的生长方式和类型
贴壁型生长细胞
悬浮型生长细胞
2基本操作
2．1无菌操作技术
2．2细胞培养技术
2．3细胞融合技术
思考题
1．细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。
2．动物细胞工程发展的主要标志性阶段。
3．植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。
4．植物细胞工程的作用与应用领域。
第一部分植物细胞工程
第一章细胞全能性及其表达
1.1概念10分钟
1.2细胞分化和脱分化20分钟
1.3器官发生10分钟
1.4体细胞胚胎发生20分钟
1.5植物组织培养40分钟
总计2学时
全能性、细胞脱分化、胚状体、器官发生。
2.细胞的脱分化过程
3.离体培养中器官发生的方式
4.器官分化过程
5.体细胞胚的形成
6.植物组织培养过程
1.植物细胞分类。
2.细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化
3.分析各种因素对器官的分化的影响。
4.影响体细胞胚发生的因素
1.离体培养中器官发生的方式。
2.细胞的脱分化和再分化。
1.掌握相关基本概念并能对几对重要概念进行辨析。
2.对分化、再分化、器官分化、体细胞胚的形成有全面深入的了解。
3.植物组织培养过程。
【教学内容】
一.概念：
一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。
植物细胞可分为三类：
第一类是茎尖、根尖及形成层细胞
第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞
第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞
分析各类细胞特点并加以区分。
二、细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
时间上的分化：
空间上的分化：
三、细胞脱分化在培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。
3.1细胞的脱分化过程可分为三个阶段：
第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；
第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；
第三阶段为终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。
3.2细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化
脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。
这些变化总体上包括：
细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。
液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。
四、器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
4.1、离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：
第一种方式是先芽后根
第二种方式为先根后芽
第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。
4.2、器官分化过程
第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。
第二阶段是“生长中心”形成。
当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。
第三阶段是器官原基及器官形成。
在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。
这一途径有两种情况：
一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；
另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。
分析各种因素对器官的分化的影响。
不同外植体类型对器官的分化是影响的。
激素对器官分化的调控：
光照对器官分化的影响：
五、体细胞胚胎发生
胚状体：
离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。
这一定义有以下几方面的界定：
其一，与无融合生殖胚不同，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用。
其二，与合子胚不同，体细胞胚起源于非合子细胞。
其三，与离体培养中器官发生形成个体的途径不同，她经过了胚胎发育过程。
5.1、体细胞胚的形成
1）从外植体上直接发生
在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：
第一个阶段为诱导期。
第二个阶段是胚胎发育期。
2）经过愈伤组织的体细胞胚发生
第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织。
第二阶段是诱导愈伤组织胚性化；
第三阶段是体细胞胚形成。
3）细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生
1.5.2、影响体细胞胚发生的因素
1）外源激素对体细胞胚胎发生的调控
2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响
3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异
六植物组织培养
介绍组织培养概念、发展历史、现状、意义。
进行植物组织培养，一般要经历以下5个阶段：
1预备阶段
（1）选择合适的外植体是本阶段的首要问题
（2）除去病原菌及杂菌
对外植体除菌的一般程序如下：
外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。
然后制备：
（3）配制适宜的培养基由于物种的不同，外植体的差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：
①含量丰富的基本成分②微量无机物③微量有机物
2诱导去分化阶段
3继代增殖阶段
4生根成芽阶段
5移栽成活阶段
1．细胞学说与细胞全能性的概念。
2．细胞分化的阶段及细胞结构的变化。
3．真核生物细胞周期调控的分子机理。
5．离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。
6．器官发生的影响因素及调控机理。
7．体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。
8．影响体细胞胚形成的因素及调控。
第二章植物细胞培养和次生代谢物的生产
1.1单细胞培养技术30分钟
1.2次生代谢物的生产30分钟
1.3细胞培养生产有用物质20分钟
1.4若干有用物质的生产20分钟
1.单离细胞的方法。
2.单细胞培养技术方法。
3.培养细胞的同步化
4.固定化细胞培养系统
1.成功的悬浮细胞培养体系必须满足的条件。
2.培养细胞的密度及生活率的测定
3.次生代谢物的生产的意义。
4.细胞培养生产有用物质和若干有用物质的生产。
1.细胞悬浮培养。
2.工业化生产次及代谢物过程。
5.能够对各种单细胞培养技术方法进行分析比较。
6.能够区分分批和连续培养及封闭与开放培养。
3.掌握平床和立拄培养系统特点。
一、单细胞培养技术
1、单离细胞的方法
（一）物理方法这是最早采用且至今仍用得最多的方法。
即悬浮培养的细胞经摇床振动使细胞分散，如果向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩空气，会使细胞分散得更好；
分离时用镍丝网进行过滤，细胞大的植物种类用200一300目，细胞小的用400目。
过滤后用500转／分密度梯度离心5—10分钟，使单离细脑沉淀在离心管底，收集之。
（二）化学方法加草酸钙l00ug/L处理胡萝卜细胞悬浮物，因草酸盐能结合细胞间质中的果胶钙的钙离子，从而获得了较分散的细胞。
另外，秋水仙碱（o．1mm01／L）或2，4—D或水解乳蛋白
对细胞分散均有一定的作用。
（三）酶法
加果胶酶和少量纤维素酶，使细胞彼此分离开来，也是单离细胞的一种方法。
酶法往往对细胞有不良影响，故此法用得较少。
2.单细胞培养技术方法
（一）液体浅层培养是先把细胞以一定的密度悬浮在液体培养基中，用吸管将悬浮液移到平皿中使之形成一个浅层。
此浅层以1mm为宜，太厚不利于细胞对氧的吸收。
用石蜡膜封住平皿后，进行静置培养。
该法的优点是培养与空气接触面大、通气好，细胞的代谢物易扩散，防止了有害物质的积累过多而造成毒害。
此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照惕。
但由于细胞可能游动，不能进行定点观察；
也可能出现细胞的集聚作用。
（二）微室培养此法的优点是可在显微镜下连续观察细胞的变化。
（三）平板培养技术是先将琼脂（琼脂糖效果更好）加热融化后冷却至43-45c时，迅速与等体积的细胞悬浮液均匀混合。
完全冷却后，培养基在培养皿中形成一平板，单离的细胞包埋于培养基内。
混合后琼脂的最终浓度控制在o．6%以下，以得到松软的固化状态，有利于细胞生长。
此法的优点是单离的细胞在培养基中分布较均匀，也便于定点观察，缺点是通气不好。
（四）看护培养看护培养也曾称为纸筏营养技术，是在一个锥形瓶中，先加入一定体积的固体培养基，培养基上放上一块几毫米大小的愈伤组织块，在此愈伤组织块上再放上一张预先灭菌过的滤纸，然后放置一个晚上，使滤纸充分地吸收愈伤组织里渗透出来的培养基成分，次日．把分离好的单细胞接种到滤纸表面。
单细胞通过滤纸从愈伤组织和培养至中吸收养分后，可以分裂形成小细胞团。
小细胞团可转移出来继代培养。
如此可促使小细胞团增殖、分化。
（五）饲喂层技术其方法是：
作饲喂层的细胞经射线照射后．核失活不能分裂，但细胞仍存活。
饲喂层细胞用平板技术制成一琼脂（糖）平板．此平板亦即“伺喂层”，然后将单离细胞以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上。
饲喂层的作用没有种的特异性，即以一种植物细胞制成的平
板．可以支持另一种的生长。
（六）悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
悬浮培养与固体培养比较有三个优点：
一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；
二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；
三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
冘悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
冘均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
冘细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。
1.培养方法
1）分批培养分批培养是将游离细胞按一定的细胞密度分散在液体培养基中进行培养，这样可以建立单细胞培养物。
分批培养所用的容器一般为100—250m1三角瓶，每瓶装20—75ml培养基，培养过程中，除气体和挥发性代谢产物可以同外界气体交换外，一切都是密闭的。
当培养基中主要营养物质耗尽时，细胞的生长和分裂即停止，为使分批培养达到细胞能不断增殖，必须及时进行继代培养，即取出一小部分细胞悬浮液，转移到成分柑同的新鲜培养基中（约稀释5倍）。
悬浮细胞培养进行继代操作时，可用吸管或注射器，不过进液口的孔径必须小到只能通过一个细胞或小细胞团（2—4个细胞），操作前应将培养瓶静置几秒钟，让大的细胞团沉淀下去，然后再吸取上层悬浮液。
在细胞培养过程中，如何使细胞充分分散于培养液中是很重要的问题，而细胞的分散性与最初用于悬浮培养的愈伤组织的松散性有密切关系，将愈伤组织在半固体培养基上继代2—3个周期，可增加其松散性；
另外，培养基某些成分也能增加细胞的分散性，如加入适量的2，4—D、纤维京酶、果胶酶、酵母提取液等均能提高培养细胞的分散性。
当然，采用上述方法可以提高细胞的分散性，但无论如何只含有单细胞的悬浮液是没有的，总存在一些细胞田．每个细胞团由几个到几十个细胞组成，这是因为植物细胞有聚集在一起的特性。
分批培养是细胞悬浮培养的一种常用方法，但由于培养过程中细胞生长和代谢方式及培养基成分在不断改变，因此对研究细胞的生长和代谢不是一种理想的方法，但其所用设备简单、操作简便、重复性好，特别适合于突变体筛选和遗传转化等研究。
2）连续培养连续培养是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方法。
在连续培养过程中．新鲜培养基的注入和老培养基的排出不断进行，这样在培养物容积保持恒定的情况下，培养液中营养物质不断得到补充。
连续培养有封闭型和开放型之分。
封闭型是指旧培养基的排出与新培养基的注入是等量进行的，排出液中的细胞经机械回收后，又被放回到培养系统中，因此，在这样的培养系统中，随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。
开放型培养与封闭型培养的区别在于新鲜培养基的加入和控制方式，开放型培养中，加入新鲜培养基的容积和排出的旧培养基及其中细胞的容积相等．并通过调节流入、流出速度，使细胞的生长速度保持在接近最高值的恒定水平上。
根据调节机制的不同，可分为化学恒定式和浊度恒定式。
化学恒定式培养是以固定速度加入新鲜培养基，选其中一种营养成分（氮、磷或葡萄糖）的浓度调节成为生长限制浓度．从而使细胞的增殖保持在稳定状态之中。
在这种培养体系中，除限制因素外．培养基的其他成分的浓度均高于细胞生长的需要，而限制因素的浓度则要调节到这样一种水平：
它的任何增减都能由相应的细胞增长速率的增减反映出来。
浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断加入的，它是由细胞密度的增加引起培养额浊度的增加来调节的——预先设定一种细胞密度，当超过这一密度时，就排出培养液及其中的细胞，再加入新鲜培养基，从而保持细胞密度的恒定。
2.培养细胞的同步化
细胞分裂周期由分裂间期和分裂期（M）经成，细胞分裂的发生是随机的，并不是人们设想的那样从某一点同时开始步调一致地完成分裂周期的各个时期，因此，一个培养体系中的细胞将会是由处于不同分裂时期的细胞组成，即是不同步的，这对于细胞分裂和代谢机制研究、大规模培养细胞来生产次生代谢产物都是不利的，这些研究和生产都要细胞分裂同步或基本同步。
为了使培养细胞同步化，进行了各种尝试，包括物理的和化学的方法，物理方法主要是通过对细胞的物理特性（细胞或细胞团的大小）和生长环境条件（光照、温度等）进行控制，实现细胞的同步化．如按细胞团大小进行选择和分别培养及低温休克方法。
化学方法是使细胞受到某种营养饥饿或是用某种因素抑制细胞分裂，这就是所谓的饥饿法和抑制法。
（1）饥饿法这种方法是在培养过程中．先停止供应细胞分裂所必需的—种营养物质或激素，使细胞停止在G1或G2期，经一段时间饥饿后，向培养基重新加入这种限制因子，静止的细胞就会同步进入分裂。
如在长春花细胞悬浮培养中，先使细胞受到磷酸盐饥饿4d，然后转移到含磷酸盐的培养基中，获得了同步化。
（2）抑制法使用DNA合成抑制剂如5—氨基尿嘧啶、羟基脲、胸腺嘧啶脱氧核苦，使细胞内DNA合成受到抑制，细胞分裂只能进行到Gl期，细胞都停在G1和s期的边界上，当把这些抑制剂去掉后，细胞即进入同步化分裂。
不过用这种方法取得的同步性只保持一个细胞周期。
3.培养细胞的密度及生活率的测定
（一）起始密度的决定
培养细胞的密度一般在104—105个／mL之间为宜，具体密度视细胞体积的大小和试验培养的效果而定。
密度的计算可采用上梅医用光学仪器厂生产的血球计进行。
（二）活细胞百分率的测定
单离细胞并不全是活的，通常只有60％以上的活细胞。
活细胞百分率的测定有助于评价细胞质量，同时对以后的培养效率有较正确的估计。
测定方法是：
先以培养液为溶剂配制o．1％的酚藏花红和用丙酮配制5mg／mL的二醋酸酯荧光素，贮于冰箱。
使用时把萤光素稀释至0.01％后，使其与细胞在载玻片上混合。
滴一滴o．1％的酚藏花红染色液于载片上后，即盖上盖玻片。
在显微镜下，被染上红色的是死细胞，而活细胞木染色。
由此可以计算出活细胞的百分率q经15—30分钟后，还可在萤光镜下观察、计数。
活细胞会在荧光素作用下发茧光，死者则不会。
（三）植板率的测定
用平板培养的需统计植板车，即每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分串。
汁算公式为：
植板率%=细胞团数/接种细胞总数*100%
其中，每平板接种细胞数＝每毫升培养液中的细胞数目×
该平板细胞培养液的毫升数
二、次生代谢物的生产
工业化植物细胞培养系统主要有两大类：
悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。
前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；
后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。
（一）悬浮培养系统
液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。
冘机械搅拌式培养系统
机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：
搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；
因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；
由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；
为便于取样观察，一般还设计有取样口。
冘气压搅拌式培养系统
考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。
冘旋转式培养系统
一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统（图3-1）。
该系统由培养罐及四根导管连通辅助设备构成。
经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。
当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定浓度时，收获细胞，提取产物。
他
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