微生物培训教程Word文档格式.docx
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FDA——鱼、水产品USDA——肉、禽产品SSOP——HACCP的基石
（二）相关定义
1.关键控制点确定程序（CCPDecisionTree）：
决定某个控制点是否是关键控制点的一系列问题。
2．连续监控（ContinuousMonitoring）：
不间断地收集数据（如温度）并将其记录在图形上。
3．控制（Control）：
（a）控制操作条件使之遵循已建立的标准；
（b）对照、描述正确的步骤已经维持且标准已达到的状况。
4．控制点（ControlPoint）：
生物、物理或化学因素需要进行控制的任何点，步骤，或程序。
5.纠偏措施（CorrectiveAction）：
当偏差出现时应遵循的程序。
6.标准（Criterion）：
作决定或判断时所依据的参数。
7.关键控制点（CriticalControlPoint,CCP）：
食品加工的某操作点、某步骤或某方法，在这些点上可以实施控制，最终使食品安全危害因子得到防止、消除或降低到可接受的水平。
8.临界偏离（CriticalDefect）：
可能会导致危害发生的关键控制点的偏离。
9.临界极限（CriticalLimit）：
所有同关键控制点相关的预防措施都必需满足的一种标准。
10.偏差（Deviation）：
偏离临界极限的状况。
11.HACCP计划（HACCPPlan）：
基于HACCP原则所建立的一套文件，描述了确保对某一特定步骤或过程进行控制的一系列程序。
12.HACCP系统（HACCPSystem）：
执行HACCP计划的一系列过程和方案。
13.HACCP小组（HACCPTeam）：
负责起草和建立HACCP计划并执行的一群人。
14.HACCP计划的审查（HACCPPlanValidation）：
HACCP小组对HACCP计划的最初的评审，以确定HACCP计划中的每一组成部分都是准确无误的。
15.HACCP计划的再审查（HACCPPlanRevalidation）：
由HACCP小组定期对HACCP计划的文件所进行的再审查，目的是要尽可能地完善HACCP计划。
16.危害（Hazard）：
一种影响食品消费安全的生物、化学或物理的特性。
17.监控（Monitor）：
执行一系列有计划的观察或检测，以评价某一关键控制点是否在控制中，并可为将来的查证过程提供准确的记录。
18.预防措施（PreventiveMeasure）：
对已经确认危害健康的化学、物理或其他因子所采取的控制办法。
19.随机检测（RandomChecks）：
用作对HACCP计划所要求的定期评价的补充观察或检测，要求避免主观性。
20.风险（Risk）：
对危害发生可能性的估计。
21.敏感性成分（SensitiveIngredient）：
已知同某一危害相关联并值得关注的成分。
22.严重性（Severity）：
某一危害的严重程度。
23.目标水平（TargetLevels）：
比临界极限更为严格的标准，操作者可用来减小发生偏差的风险。
24.查证（Verification）：
为了确定HACCP系统是否遵循HACCP计划或确定HACCP计划是否需要完善和再审查，除了监控中使用的方法、程序或测试以外，还要使用其他方法、程序和测试加以核实。
（三）HACCP的七要素（原则）：
（1）危害分析；
（2）关键控制点的识别；
（3）各关键控制点临界极限的确定；
（4）建立各关键控制点的监测方法和处理监测结果的程序；
（5）建立各关键控制点偏离临界极限时的校正方案；
（6）建立HACCP系统的有效记录档案制度；
（7）建立确认HACCP系统是否运转正常的程序。
（四）HACCP系统的特点
HACCP——预防策略——有效、减少损失——全面性、系统化
Farm——Home生产商、销售商、消费者、政府部门
——严格档案制度——分清责任——国际公认
（五）对HACCP的评价
美国科学院——对微生物危害的控制必须采用HACCP系统，对终产品的检验不是防止食品传播疾病的一种有效方法。
美国食品的微生物学标准顾问委员会——保证食品从原料种植到餐桌的安全的一项有效而又合理的策略。
国际食品安全协会——HACCP系统是保证食品安全与完善的最佳方法。
FAO/WHO联合食品法典委员会——HACCP是控制由食品引起疾病的最有效方法。
四.微生物快速自动检测技术
（一）微生物快速自动检测技术
在HACCP系统中的地位：
微生物快速自动检测技术在科学研究、工业生产、医药卫生和环境保护等领域的应用日益广泛，我国在这一方面还很落后，只对少数几项技术予以了引进和研究，实现了商业化的技术甚微。
我国加入WTO在即，农产品、食品、饲料的安全性日益受到重视，农产品、食品、饲料的生产要求逐步按HACCP系统要求对生产——消费的每个可能发生安全问题的环节都要进行微生物检测。
于是，引进、消化和研究微生物快速自动检测技术迫在眉睫。
（二）微生物快速自动检测技术类型
1.生化反应快速检测试剂盒：
API20ERSystem、EnterotubeⅡR、Micro-IDR、MinitekTM
*CrystalTMIdentificationSystem、RapIDOneSystem、RapIDTMANAⅡSystem
2.计算机自动化分析鉴定系统：
BiologTM、ATBRIdentification、MicroTeamR
3.活细胞计数检测：
Petrifilm、Redigel、HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem、SpiralAssaySystem
4.估计微生物数量的新方法：
阻抗测定，如BactometerR系统
电导测定，如MalthusMicrobialAnalyzer系统
生物发光和ATP酶检测，如BioluminescenceandATPanalysis
5.免疫学方法检测：
Transia卡片检测法、TECRA系统、VIDAS系统、Biocontrol1-2Test
6.分子生物学方法：
ProbeliaTM、BAXR系统、Gene-TrakR
（三）生化反应快速检测试剂盒
1.API20ERSystem：
是一种基于传统的肠杆菌科和其他G-细菌生化鉴定方法上的标准化、小型检测试剂盒。
它将23种生化反应集中设计在一个微型管系统中，管内装有脱水反应底物和指示剂，接种培养后通过颜色变化呈现阴、阳性结果。
可以在18-24hr内鉴定肠杆菌科，18-24hr或38-48hr内鉴定其他G-细菌。
优点：
为商业化产品，简便易得，数据可靠。
缺点：
接种较费时；
塑料板易变形；
需有微生物工作经验者分析结果。
2.EnterotubeⅡR是一支长形塑料管，包含有分割开的12种不同的培养基和中间的一根接种针。
这根针可将单个细菌菌落同时接种于15种标准生化反应系统中，结果可由计算机软件来分析鉴定。
接种快速简单；
不需为接种做准备工作；
鉴定时可选用单菌落
缺点：
只能鉴定氧化酶反应阴性的G-菌和肠杆菌科细菌；
在培养箱中堆放较困难；
因脱水而带来货架期缩短。
3.Micro-IDR
：
这是一种鉴定肠杆菌科细菌的反应盘，由苯乙烯塑造而成，包括15个反应小室和一个铰链连接的盒盖。
其中5个反应小室中只含有一种混合反应底物，其余10个小室中各包含一种混合反应底物。
通过反应的颜色变化来分析结果。
准确，与传统生化鉴定方法有95%以上的吻合性；
快速，在经简单分离后，只需4小时培养即得出结果；
可靠，反应底物是包装在锡箔袋中，保存期长。
仅针对肠杆菌科细菌，尤其是细胞色素氧化酶阴性的G-菌；
需微生物工作者读结果。
4.MinitekTM主要用于实验室对肠杆菌科和各类G-好氧微生物的辅助鉴定，通常针对那些“非发酵型细菌”。
它是一个由多个小圆盘组成的纸盘，每个小圆盘中盛有不同的生化反应底物和指示剂，经接种培养后呈现特定颜色反应。
优点：
多功能性，当将小圆盘内的反应底物更换一下，就可用来鉴定其他微生物；
结构稳固，不易损坏；
可在培养箱中简单的堆放。
5.CrystalTMIdentificationSystem：
是改良的传统发色底物制成的小型鉴定体系，主要用于肠杆菌科中典型的好氧G-菌以及人类病原的不发酵葡萄糖的G-杆菌。
该鉴定盘包含有30种干燥的生化酶反应底物，当加入细菌培养液后底物复水，培养后指示剂显色。
反应盘坚固，可以在一个盒中垒放10个；
计算机辅助读结果；
除肠杆菌科细菌外，还可鉴定一些非发酵型微生物。
只能用棉拭接种；
培养箱要保证一定湿度，
以防水分挥发。
6.RapID-OneSystem：
运用传统显色底物来定性鉴定肠杆菌科和一些从人类临床病样中分离到的氧化酶阴性、G-细菌。
该系统包含一个反应盘和反应试剂。
反应盘是一个塑有很多反应孔的一次性塑料板，每个反应孔中含有脱水底物，经RapID培养液增菌的细菌悬浮液可同时接种于反应孔中，结果可通过计算机数据比较。
在4hr内提供结果；
有明显的颜色反应，减少了判断时的主观因素；
准确灵敏；
只需一步接种。
需要微生物工作者解释结果；
不同厂家会提供不同的鉴定操作表格。
（四）计算机自动化分析鉴定系统
1.BiologTM：
利用细菌对95种不同碳源的代谢情况来鉴定菌种。
在96微孔板中预填充并脱水干燥的95种不同碳源，并加入显色剂。
若细菌利用某种碳源，发生代谢反应，则会在某一孔的位置上产生紫色。
再通过查询Biolog数据库，就可得知细菌种类。
拥有大量菌种数据库，可鉴定2000余种，包括501种G-菌，318种G+菌，363种厌氧菌，267种酵母菌，600种丝状真菌和45种放线菌，准确率达95%以上；
操作简便。
接种菌悬液时易失误
2.ATBRIdentification：
半自动化微生物鉴定系统，包括密度计、自动阅读机、计算机、自动移样管、应用软件等部分。
每个试验条含有32个单独的吸盘，吸盘中含有不同反应底物和生化试剂，经接种培养后，ATB系统通过对吸盘中混浊度和颜色的变化来分析鉴定菌株，结果自动输出。
3.MicroTeamR：
这是一种快速自动化微生物鉴定系统，是Bactometer系统和VITEK系统的组合。
其中，Bactometer系统可利用阻抗变化来测定微生物活动，从而在6-48hr内鉴定多种微生物；
而VITEK系统有四部分组成：
将一定浓度的菌液真空填充到该系统提供的菌种鉴定试验卡中的真空填充器、自动为试验卡封口的封口器、培养此卡可调温的培养箱、在培养的同时每小时检测一次颜色和浊度变化并分析数据的计算机。
计算机收集每小时的数据，由数据库进行分析比较判断出菌种的种类。
（五）活细胞计数检测
1.Petrifilm（皿膜系统）：
这是一张制好的卡片，由两个粘在一起的塑料薄膜组成，在一边膜上涂布有培养基成分和溶于冷水的凝胶剂。
可进行好氧培养计数（APCs）,也可使用选择性培养基检测特殊菌群。
在两薄膜中间滴加1mL的稀释液，适当温度下48hr左右就可菌落计数。
通过AOAC等机构认证；
无须制备培养基，提高了检测效率；
每个膜上都有颜色指示剂，故特定菌落显示特定颜色，方便计数；
大肠杆菌计数卡中的大肠杆菌菌落是蓝色并伴有气泡的；
无论对于大小实验室均实用，尤其适合野外测定。
低pH和低湿度的样品需要另外稀释。
2.Redigel（即用胶系统）：
此系统具盛有无菌液体培养基的试管，把样品（譬如1mL食物样品）倾入该试管中，混匀后再将混合物倒入一个装有胶质的特殊培养皿中，混合物与胶质接触后便形成与琼脂相似的复合物，经培养后可计菌数。
已包装好的，无须灭菌；
减少了培养基制备过程；
应用领域多，适合野外测定；
此种培养基不会被一些果胶分解菌水解。
3.HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem（疏水格栅过滤系统）：
此法中所用的膜为特殊的含有1600个蜡质网格的防水膜，每格限制微生物的生长和菌落大小。
1mL的样品处理匀液经过此滤膜过滤后，将膜置于琼脂培养基表面恒温过夜，用MPN自动计数。
受伤细胞可在非选择性培养基上复苏后，再移至选择性培养基上；
能将水中可能影响微生物生长的水溶性物质去除；
含量很低的微生物菌悬液经过滤后浓度大，便于检测；
每个菌落都是正方形，便于人工或机器计数。
4.SpiralAssaySystem（旋转平板法）：
平板中预注入培养基并凝固，液体接种物经特制注射器涂布在此旋转的平板上，散布器从平板中心移至外围，样品即被涂布在一条阿基米德线上。
注射器不断增加散布样品的体积量，使得在一个平板上的浓度范围达10000：
1。
在适当温度下培养，平板中心菌落浓度较高，边缘较低。
通过特殊的格状计数器对旋转平板的菌落计数。
已通过AOAC认证；
所用的琼脂少；
所需培养皿、稀释液空白、吸管少；
每小时可涂布50-60个平板，操作中不需调试。
食品样品中的颗粒可能会使注射器的针头堵塞。
（六）估计微生物数量的新方法
1.阻抗测定，如BactometerR系统：
原理：
当微生物的生长和降解代谢营养物质时，液体中的大分子变为小分子，从而引起液体内部阻抗和导电变化。
操作过程：
样品经过一定的程序处理后装入随仪器提供的小室中，在培养的同时测定阻抗的变化，所有测量数据由系统中的计算机处理。
当微生物代谢基质并达到105-6细胞/mL时，阻抗积聚增加，检测屏幕上出现类似生长曲线对数生长期的斜线，阻抗发生变化的时间为检测时间，和样品中微生物量呈反比。
此方法主要用于牛奶、乳制品、肉制品和其它食物中微生物的测定。
2.电导测定，如MalthusMicrobialAnalyzer系统：
与测阻抗类似，该系统是测定电导变化来评估微生物量。
自动化；
对抗原和其它微生物的快速鉴定有高效性；
可在一台仪器上进行多种试验；
细胞可回收利用；
操作简便；
可随时抽样；
容量大，可同时检测1200种样品；
软件大众化，易运行。
3.生物发光和ATP酶检测，即BioluminescenceandATPanalysis产品如PocketSwabTM
所有生物都含有ATP，当萤火虫荧光素酶系统和ATP接触时就会发荧光。
发光量和样品中的ATP的量成正比，可用荧光计来测量发光量。
快速方便，40秒出结果；
可用于卫生监督和生产线监控；
能达到传统方法的全面、复杂度；
产品经过ATP试验后仍可商用。
（七）免疫学方法检测
1.Transia卡片检测法：
此法以单步免疫反应即夹心型免疫色谱反应为基础。
反应固相包括一块用“特异性抗体-染料”偶合物浸透的染料衬垫和一张薄膜条，抗该种菌的抗体就固定在薄膜的反应区上。
增菌后的菌液用移液管加到点样小孔中并令其吸收，若样品中存在该种菌的抗原，就会与偶合物作用，然后依次迁移到膜上，与固定在膜上反应区的抗体结合，在反应窗上呈现一条色带，结果可在5-7分钟内读取。
2.TECRA系统：
Enzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）酶联免疫分析
检测过程：
微量孔中预先包被有待检菌的特异性抗体，当样品加入后，若存在此种菌，则会与该抗体结合而被捕获，随后加入酶标抗体，就形成了“抗体-抗原-酶标抗体”复合物，最后加入显色剂，在酶作用下呈现颜色反应，若呈现绿色则为阳性，无色则为阴性。
可肉眼判断，也可通过微量比色计读取结果。
3.VIDAS系统：
Enzyme-linkedFluorescentimmunoAssay（ELFA）酶联荧光免疫分析
样品中的目的检测物或抗原被固相捕获，而非特异性抗原则被洗去，特异性抗体和碱性磷酸酶复合物与固相反应并结合，未结合上的则被洗去。
底物4-甲基-伞形酮就会和这些已结合在固相上的酶起反应而产生荧光，荧光量与结合在固相上的酶成正比，通过荧光检测器和计算机处理系统输出结果。
4.Biocontrol1-2Test：
是一种检测有动力沙门氏菌的试剂盒。
在一个特殊的含两个容器的塑料设备中，一个容器中装有选择性半固体培养基，另一个中装有非选择性培养基，并含有鞭毛抗体。
恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。
将血清学反应和生化增菌过程结合起来；
简便易用，不需特殊实验室条件；
结果在8-14小时内得出。
不能检测非运动型沙门氏菌免疫条带的判断有主观因素。
（八）分子生物学方法
1.ProbeliaTM：
一种特异性快速检测食品中病原菌的自动化设备。
根据待测细菌设计特异DNA引物，与待测细菌内相应保守序列结合后进行PCR特异性扩增，扩增产物再和预先设计好的过氧化物酶标记的分子探针进行分子杂交，结果通过比色检测装置读出。
针对保守序列设计引物和探针，故具有高度特异性；
PCR扩增可检测极低含量菌体，故灵敏度高
2.BAXR系统：
BAX系统利用PCR仪以极快的方法扩增目标病原菌的特定DNA片段至可测的水平，而其他微生物由于没有相同的特定DNA片段，因而不能被扩增。
所以，BAX系统具有很高的专一性。
BAX系统将所有的试剂（引物、聚合酶等）均预制成一个片状物放在PCR反应试管中，不需要对病原菌DNA进行分离，检出结果明确肯定，使得病原菌的检测和确认一次完成，因此，整个检测过程快速、准确、操作简单。
3.Gene-TrakR原理：
针对被检微生物的核糖体RNA（rRNA）设计一段特异寡核苷酸序列，进行特异性杂交。
核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细胞中存在5000-20000个复制体，相比之下染色体DNA复制体仅2-10个，因此检测的灵敏度高。
而且由于rRNA为单链（而DNA为双链），杂交前无须经过变性步骤，较快速。
要得到阳性结果，只需105个靶细胞/mL。
第二部分分布、分类和生长参数
第二章食品中常见的微生物
Commonfoodbornemicroorganismsinfoods
食品中常见的细菌属概要：
假单胞菌属：
革兰氏阴性、极生鞭毛、可运动、不生芽孢、杆状，新鲜食品中的优势菌，常存在于土壤和水中，广泛分布在食品中。
另外，许多菌株是嗜冷，是导致新鲜冷冻食品腐败的重要细菌。
有时腐败能产生水溶性蓝绿色素。
产碱杆菌属：
革兰氏阴性棒状杆菌，但菌体着色时有时也显现革兰氏阳性反应，周身鞭毛，无芽孢，严格好气，化能有机营养型，大多营养简单。
不能发酵糖类，但能产碱（特别是在石芯乳中）。
不产色素，分布在各种腐烂物质中，并大量存在于原乳、食用家禽制品以及排泄物中。
沙雷氏菌属:
革兰氏阴性、杆状、好氧，能分解蛋白质，有时能产生红色素，而不产色素的菌株则比较少见。
液化沙雷氏菌是与食物中毒相关的最常见的菌株，能够引起冷冻蔬菜以及肉类制品的腐败。
弧菌属:
革兰氏阴性，直形或弯曲形杆菌，极生鞭毛，兼厌气性，通常需要一定浓度的盐，可污染咸鱼咸肉，有几株菌株能够引起人体肠胃疾病或其他疾病。
志贺氏菌属:
杆状、不运动、无芽孢、无荚膜、革兰氏阴性，不能利用柠檬酸盐，能产酸但不产气。
该属所有菌株都可存在于人体肠道中。
气单胞菌属：
典型的水生革兰氏阴性棒状杆菌，极生鞭毛，兼厌气性。
能发酵糖类产生大量气体。
通常出现在鱼体中。
弯曲杆菌属：
革兰氏阴性，弯曲成螺旋杆状，曾归入弧菌属，厌氧或微好氧。
梭状芽孢杆菌属：
杆状，革兰氏阳性，形成的卵圆形芽孢使母细胞膨胀成梭状，厌气性。
能分解糖产生多种有机酸、并产气，有的能产生毒素。
该属包括许多菌株，有些会引起人体疾病。
中温型，嗜冷型，嗜热型菌株都存在。
类芽孢杆菌属:
这个新建立的属主要包括以前属于芽孢杆菌属以及梭状芽孢杆菌的菌株。
莫拉氏菌属：
革兰氏阴性短杆菌。
它们的新陈代谢是氧化性的，同时葡萄糖发酵过程中不产酸。
索丝菌属：
革兰氏阳性、杆状，不产芽孢。
对数期的细胞为棒杆状，而衰老后则为球状。
通常存在于肉类以及冷藏温度下保存的肉类制品中。
柠檬酸杆菌属：
革兰氏阴性、杆状、周生鞭毛，无芽孢，兼厌气性，能产酸、产气。
所有菌株都能利用柠檬酸盐为惟一碳源生长，能存在于肠道中进行缓慢的乳糖发酵，有的种能引起食品腐败和人的肠胃炎。
肉杆菌属：
革兰氏阳性、杆状，过氧化氢酶阴性。
异型发酵，绝大多数能在0~45。
C生长。
有些种能发酵葡萄糖产生气体。
它们与乳酸杆菌的区别在于不能在醋酸盐培养基上生长，在代谢过程中能够合成油酸。
通常存在于真空包装的肉制品或相关制品中。
棒杆菌属：
棒杆状，革兰氏阳性，与部分蔬菜以及肉类制品的腐败有关。
是重要的嗜冷菌，但大多数菌株都是中温型。
其中白喉棒杆菌能够引起人体白喉病。
黄杆菌属：
革兰氏阴性、杆状，在琼脂平板上或植物中能生成黄、红色素，极生鞭毛，可运动，好气或兼性厌气。
有些菌株为中温型，有些是嗜冷型，与冷藏肉制品以及冷冻蔬菜的腐败有关。
交替单胞菌属：
革兰氏阴性、杆状，能运动，严格好氧。
大量存在于海洋或沿海水域中、以及海洋食品中。
生长需要海水中较高浓度的盐。
哈夫尼菌属：
革兰氏阴性、杆状，常存在于肠道中，可引起冷冻肉制品及蔬菜制品的腐败。
其DNA中（G+C）的摩尔分数为48%～49%。
考克氏菌属：
从微球菌属拆分出来的新属。
DNA中（G+C）的摩尔分数为66%～75%。
明串珠菌属：
革兰氏阳性、不形成芽孢、球状、排列成对或成链状，兼厌气性。
经常与乳酸球菌同时出现，是乳酸细菌的另一个属。
过氧化氢酶阴性，异型乳酸发酵。
变形菌属：
革兰氏阴性、杆状，常表现出多种形态，无芽孢，周生鞭毛，运动性强，兼厌气性，能产酸，通常存在于人体或动物的肠道内。
有较强的蛋白质分解能力，是食品的腐败菌，可引起食品中毒。
肠球菌属：
菌体呈卵圆形，单个、成对或短链状。
该属至少有三个种不与D型抗血清发生反应。
肠杆菌属：
革兰氏阴性，杆状，周生鞭毛，无
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