MEGA30使用方法Word格式文档下载.docx

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二、实验原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如（G+C）mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。

5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；

23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。

而16SrRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鉴定细菌，其技术路线如下：

细菌基因组的提取：

PCR的基本原理：

变性、退火、延伸

二、操作步骤

1、细菌基因组DNA提取；

2、PCR扩增；

3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；

4、扩增片段回收；

5、DNA片段测序。

三、结果处理与分析

在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的BindingBuffer为1200μl。

我们小组选用B316Ssequence，以下为制作进化树过程：

1、访问网址http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/，进入以下界面：

2、点击BLAST链接，进入如下界面：

3、点击nucleotideblast链接，进入如下界面：

4、将B316Ssequence复制到上图所示的输入框内，并将ChooseSearchSet中的Database选择Others，如下图所示：

5、点击该网页下面的BLAST链接：

进入如下界面：

一会后，上图所示界面自动跳为如下界面：

6、在该界面下面所示的序列中勾选合适的序列

7、勾选合适的序列后，点击Getselectedsequences链接，进入如下界面：

8、勾选15个结果，点击sendto后CreateFile，文件格式设置为FASTA，如下图所示：

9、用MEGA-4.0软件打开上述下载后的sequence文件，如下图所示：

10、将未知序列B3导入

11、修改未知序列名称

12、点击Alignment——AlignbyClustalW对所有序列进行比对排序，如下图所示：

13、删除前端和末端相对于B3多余的碱基序列，结果如下图所示：

14、点击data——ExportAlignment——MEGAFormat,将文件保存为MEG格式。

中间出现如下弹窗时选择NO：

15、用MEGA-4.0软件打开上述MEG格式文件，点击Phylogeny——BootstrapTestofPhylogeny——Neighbor-Joining,如下图所示：

出现如下对话框

16、点击PhylogenyTestandoptions行右侧的绿色方框，在弹出的对话框中将Replications设置为1000，点击左下角的

键，如下图所示：

17、点击Model行右侧的绿色方框，Nucleotide。

点击Compute键，构建进化树如下图所示：

18、结论：

分析所绘制的进化树可以推论：

B3菌株可能为Staphylococcus（葡萄球菌）。

电泳图谱：