1、二、实验原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适
2、合PCR扩增,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。 16SrRNA的编码基因是16SrDNA,但是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:细菌基因组的提取:PCR的基本原理 :变性、退火、延伸二、操作步骤1、细菌基因组DNA提取;2、PCR扩增;3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测;4、扩增片段回收;5、DNA片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时,紫外灯下条带呈现绿色荧光,将凝胶
3、中绿色荧光部分切割分离出来,放入已称重的2ml离心管中,空的离心管为1.02g,放入回收的凝胶后为1.42g,则凝胶为400mg,因此加入的Binding Buffer为1200l。我们小组选用B3 16S sequence,以下为制作进化树过程:1、访问网址http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/,进入以下界面:2、点击BLAST链接,进入如下界面:3、点击nucleotide blast链接,进入如下界面:4、将B3 16S sequence复制到上图所示的输入框内,并将Choose Search Set中的Database选择Others,如下图所示:5、点击该网页下面的B
4、LAST链接:进入如下界面:一会后,上图所示界面自动跳为如下界面:6、在该界面下面所示的序列中勾选合适的序列7、勾选合适的序列后,点击Get selected sequences链接,进入如下界面:8、勾选15个结果,点击send to后Create File,文件格式设置为FASTA,如下图所示:9、用MEGA-4.0软件打开上述下载后的sequence文件,如下图所示:10、将未知序列B3导入11、修改未知序列名称12、点击AlignmentAlign by ClustalW对所有序列进行比对排序,如下图所示:13、删除前端和末端相对于B3多余的碱基序列,结果如下图所示:14、点击data
5、Export AlignmentMEGA Format,将文件保存为MEG格式。中间出现如下弹窗时选择NO:15、用MEGA-4.0软件打开上述MEG格式文件,点击PhylogenyBootstrap Test of PhylogenyNeighbor-Joining,如下图所示:出现如下对话框16、点击Phylogeny Test and options行右侧的绿色方框,在弹出的对话框中将Replications设置为1000,点击左下角的键,如下图所示:17、点击Model行右侧的绿色方框,Nucleotide。点击Compute键,构建进化树如下图所示:18、结论:分析所绘制的进化树可以推论:B3菌株可能为Staphylococcus(葡萄球菌)。电泳图谱:
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