细胞生物学标书模板Word格式文档下载.docx

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国内已进入老龄化社会，是世界上老年人口最多国家，预测到本世纪中叶，老年人口将达到4亿。

同步随着人们生活水平不断提高、膳食不当、生活习惯和外部环境等各种因素，近年来心血管疾病已成为国内发病率和死亡率高居第一疾病[1]，严重影响着人们生命健康，其发病及防治受到全社会极大关注。

二、国内外研究现状和发展趋势

近年来，分子生物学和细胞生物学研究成果促使心血管药理学内容日新月异地更新，对心血管病症研究相对成熟，大某些心血管有关基因研究比较清晰，药物作用靶点也相对明确[2].而国内老式中药丹参及其复方在治疗冠心病、动脉粥样硬化方面以其疗效确切、副作用小、安全、经济等长处，成为临床最惯用治疗血瘀症冠心病中药。

丹参为唇形科近年生草本植物丹参（Salviamiltiorrhiza）根茎，始载于《神农本草经》。

丹参化学成分当前已研究得较为系统，重要为共轭醌、酮类化合物，酚酸类物质，具备较广泛药理作用，其中对循环系统影响研究得较多[3-4]，大量药理学研究表白，丹参具备抗心肌缺血、舒张血管、保护内皮损伤、缩小心肌梗塞面积，抗自由基、减少缺血再灌注心肌损伤，保护心肌高能磷酸化合物等广泛心血管活性[5]。

药代动力学研究成果表白，丹参素和儿茶醛可经肌肉和胃肠道吸取入血，隐丹参酮口服吸取较差或吸取后迅速被肝脏转化，一某些一方面转化为丹参酮ⅡA，后者进一步被羟化代谢为含羟基代谢物，并结合内源物使极性增大而利于排出。

分子药理学研究表白复方丹参可通过影响基因表达调控达到治疗作用，如丹参可抑制血管内皮细胞和粒细胞表达CD11b、ICAM-1、E-selectin等粘附分子[6-7]，抑制血管平滑肌细胞表面CD54等粘附分子表达，减少血小板膜粘附分子CD41、CD62P、和P-选取素表达，丹参酮可以抑制心肌细胞c-jun基因表达等[8-9]。

国际上对其保护心血管作用研究亦逐渐增多；

日本学者研究表白，丹参提取物可抑制血小板汇集[10-11]；

台湾学者近期研究表白丹参提取物对TNF-α所致积极脉内皮细胞粘附分子表达抑制作用呈剂量依赖关系[12]。

但丹参保护心血管作用药理研究仍不够进一步，特别是其作用途径、靶标不甚明晰。

王升启专家领导研究组对复方丹参方保护心血管作用分子机理以及四物汤化学成分组合补血作用及其机理研究进行了一定摸索[13]，并据此提出“化学基因组学”理论，以为中药复方是通过化学成分组合影响到信号分子组合，使紊乱信号分子网络恢复平衡，从而达到治疗中医证和有关疾病作用和效果[14-15]。

本项研究旨在摸索中药丹参保护心血管作用分子机理，通过化学组学、基因组学及蛋白质组学技术发现其作用“组合靶标”，在“化学基因组学”研究技术平台层面上进行成分-靶标互相作用研究，进而验证丹参保护心血管作用靶标以及找到疗效确切、安全经济单体及其组合，为高技术含量中药研发、产业当代化和国际化提供某些基本数据。

三、项目重要研究开发内容和技术核心

1.重要研究开发内容

1.1基于表达谱生物信息学药靶发现

运用靶标有关基因芯片、蛋白质组学和基于表达谱生物信息学药靶发现技术，从血淤证模型中发现候选靶标。

1.2基于化学基因组学成分-靶标互相作用研究

采用实时荧光RT-PCR、WESTERN印迹等技术，在血瘀证模型（血管内皮、平滑肌、心肌及血小板）上观测有效单体及组合对各作用靶标及其通路和网络调控作用，初步拟定各有效成分作用靶分子及特异性；

然后采用生物质谱及亲和色谱等技术，在分子水平上分析有效成分与靶分子结合性能，从而验证成分和靶标可药性；

最后在动物体内验证有效成分（组合）对靶标（组合）作用有效性。

通过基因芯片及蛋白质组技术实验初筛获得8-15个潜在靶标，并进一步通过生物信息学筛选4-5个候选靶标，结合反义及siRNA技术，对候选靶标进行特异性验证，获得1-2个丹参有效成分作用靶标。

针对上述靶标，研究丹参有效成分及其组合（配伍）对其表达和调控影响，获得成分与靶标互相作用实验数据。

2.核心技术

基因表达谱分析：

结合生物信息学分析，筛选心血管有关基因并制备相应表达谱分析芯片。

运用该芯片研究丹参方有效成分及其组合在细胞和动物模型上对靶细胞和组织基因表达谱影响，通过软件分析找出差别表达基因。

蛋白质表达谱分析：

将对照及模型组蛋白质分别进行荧光标记后，进行双向电泳，成果用扫描仪扫描并采用蛋白质组学分析软件（Imagemaster2DElite图象分析软件、Imagemaster2DDatabase数据库软件）进行分析比较，找到特异表达蛋白，并对特异蛋白进一步采用质谱分析其构造和功能。

候选靶标生物信息学筛选：

采用本室开发基于基因表达谱基因分类系统Tclass和基于表达谱样本类型自动辨认整合方案SamCluster进行靶标筛选和生物信息学验证，结合功能基因组和疾病基因组研究成果，筛选出候选靶标。

基于化学基因组学“成分-靶标”互相作用关系分析：

依照有效成分、靶标选取均匀、正交或析因等记录学办法设计实验，并对数据以简朴有关分析、典型有关分析、多元回归分析等各种分析办法分析“成分-靶标”互相作用关系。

3.拟解决核心问题

3.1分子间互相作用网络构建及基于表达谱和分子互相作用网络组合靶标筛选办法

心血管疾病是研究相对成熟疾病，大某些心血管有关基因研究比较清晰、药物作用靶点也相对明确。

咱们拟基于既有心血管疾病有关基因及功能、生物信息学、蛋白质/基因表达谱、酵母双杂交及药理学等研究基本，参照文献软件及数据库等信息资源，构建心血管有关基因和药物靶标分子互相作用网络。

在咱们原先建立基于基因芯片表达谱聚类、分类软件及算法基本上，进一步建立基于心血管疾病有关基因网络组合靶标筛选办法。

3.2丹参有效成分组合选取：

依照前期文献及本实验室研究工作基本，采用丹参有效部位丹参总酮、丹参总酚酸、丹参总提物及其重要有效成分丹参酮IIA、丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛等几种单体成分，分别在有效部位及有效单体两个层次上进行正交或析因设计，结合细胞、血小板汇集等高通量模型，初步筛选出其候选有效成分组合2-3组。

对候选组合进一步在动物模型上进行系统药理学验证，选出有效成分组合。

该组合及其成分可以作为组合靶标发现和功能验证工具药。

3.3有效成分-组合靶标间交互作用关系实验设计及学分析

采用均匀、正交或析因设计、基因芯片及Western印迹研究其不同组份有效组合对组合靶标表达影响；

采用“典型有关分析（canonicalcorrelationanalysis）”等记录学办法，研究各有效成分对组合靶标表达调控协同效应

四、项目预期目的

A．建立“化学基因组学”研究技术平台，并据此阐明丹参保护心血管作用机理；

B．刊登3-5篇高水平SCI论文，申请1-2项专利，培养4-5名本科生。

五、项目实行方案、技术路线、组织方式与课题分解

1.项目实行方案：

运用生物芯片技术结合蛋白质组学、化学组学、生物信息学及记录学等技术，在分子、器官及整体水平上发现丹参作专心血管疾病有关基因和蛋白表达调控靶标以及功能验证，进一步将作用不同靶标有效成分进行配伍，并运用上述技术平台进行验证，以期发现丹参有效成分为基本最佳“分子配伍”。

从而实现多层次、多靶点、多学科地研究、阐明丹参保护心血管作用物质基本及分子机制，并为探讨配伍科学内涵提供实验数据。

1.1丹参有效成分分子作用通路筛选

选取丹参提取物及其有效成分，采用细胞和动物模型，用基因芯片和蛋白质组学等高通量分析技术，研究其对基因和蛋白表达谱影响，采用生物信息学软件（Image4.0、Arraysight、Imagemaseter2DElite图象分析软件、Imagemaster2DDatabase数据库软件）进行差别比较分析。

结合表达谱数据及文献数据库构建心血管有关基因网络。

采用开发Tclass和Samclass进行聚类和分类分析，结合功能和疾病基因组学手段和知识筛选出丹参有效成分作用分子作用通路。

1.2丹参有效成分分子作用通路功能验证

对发现候选组合靶标进行分析，如果是已知功能基因或蛋白质则直接进行组合筛选；

如果是新基因或蛋白质则一方面进行构造和功能研究；

然后采用反义核酸、siRNA技术，RT-PCR技术，Western印迹技术等在细胞和动物模型上对丹参有效成分分子作用通路进行组合功能验证。

1.3丹参有效成分最佳“分子配伍”筛选

进一步用丹参有效单体不同成分、不同剂量、不同比例配伍依次在细胞和动物模型上对候选组合靶标进行验证，在“化学基因组学”研究技术平台层面上进行有效成分派伍研究，以期找到疗效确切、安全经济单体及其组合。

2.技术路线（课题分解）：

2.1设计并制备人心血管有关芯片：

依照心血管疾病有关文献，设计并制成低密度寡核苷酸芯片。

从Cardio数据库（CardiovascularDiseaseRelatedDatabase）中找出大概400种心血管疾病有关基因，这些基因人类mRNA序列来自GenBank。

使用大规模探针设计软件Mprobe来设计寡核苷酸探针，芯片质控办法采用阳性对照结合看家基因和阴性对照，对逆转录、杂交过程进行监测和成果分析。

2.2建立损伤细胞模型：

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成涉及许多环节，涉及脂质代谢紊乱，血管内皮细胞损伤，平滑肌细胞增殖，从中层迁移到内膜下，单核和巨噬细胞迁移、增生和分化，泡沫细胞形成，细胞坏死和脂质沉积等。

本项研究拟建立以TNF-α（2ng/ml）、oxLDL（12.5μg/ml）损伤血管内皮、平滑肌、心肌及血小板模型。

2.3丹参重要单体对人血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等药理作用筛选：

选取药理实验剂量范畴；

凋亡保护实验；

白细胞粘附实验；

凝血纤溶物质（PAI-1，tPA）分泌；

NO分泌；

内皮素-1分泌；

平滑肌细胞增殖实验。

2.4丹参有效成分保护心血管作用表达谱及蛋白质组学研究：

丹参有效成分孵育内皮细胞、平滑肌细胞等6-12小时，再以TNF-α、oxLDL刺激6小时，提取细胞RNA及总蛋白进行表达谱及蛋白质组学研究，发现差别表达基因及蛋白，作为丹参有效成分潜在靶标。

2.5丹参有效成分保护心血管作用机理研究及靶标验证：

以反义核酸、siRNA技术，Q-RT-PCR、WesternBlot及通路抑制剂等技术研究丹参有效成分及其组合保护心血管作用分子机制及功能验证。

2.6丹参有效成分保护心血管作用动物实验及临床观测：

2.6.1观测丹参活性组分对实验性动脉粥样硬化家兔治疗作用。

雄性新西兰兔高血脂饲养12－16周形成实验性动脉粥样硬化，予以高脂饮食同步予以丹参活性成分，4，8，12，16周末采血检测血流变、血脂状况，于16周时处死，测定血脂变化TC、TG、LDL-C，血清和血管壁中NO和ET－1含量变化。

测定颈动脉受损内皮细胞黏附因子VCAM－1变化。

与阳性对照药复方丹参方及辛伐她汀比较。

2.6.2观测丹参活性组分对实验性高血脂症家兔治疗作用。

雄性新西兰兔高血脂饲养2周形成实验性高血脂症，然后分组持续予以高脂饮食和丹参活性成分，4周后高脂给量减半，继续予以丹参动脉粥样硬化活性成分至6周，测定给药后4和6周时血脂变化TC、TG、LDL-C，血清和血管壁中NO和ET－1含量变化。

测定颈动脉受损内皮细胞黏附因子VCAM变化。

2.6.3观测丹参活性组分对大鼠缺血再灌注（Ischemicreperfusioninjury，IRI）影响，对血栓烷Ａ2和前列环素（TXA2/PGI2）比值调节作用，以及一氧化氢（NO）、内皮素（ET－1）、纤维蛋白原（Fig）水平，改进血液流变性等作用，改进ＩＲ病理生理。

与阳性药物复方丹参方比较。

2.6.4观测丹参活性组分对高黏滞血症家兔和急性高黏滞血症模型大鼠血管内皮分泌功能影响，采用复合因素（高分子右旋糖酐、肾上腺素、牛血清白蛋白）、长时间（11d）导致高黏滞血症慢性模型；

采用１次性静脉注射高分子右旋糖酐，皮下注射肾上腺素导致急性高黏滞血症模型。

分别用丹参活性组分进行治疗，观测血管内皮细胞分泌功能变化及丹参活性组分干预效果。

检测指标：

红细胞变形能力，红细胞比容、红细胞汇集指数，红细胞电泳时间；

血液流变性；

全血比黏度、血浆纤维蛋白原；

血小板汇集和黏附性及TXB2、6－Keto－PGF1α含量影响；

血管细胞黏附因子VCAM、ICAM、E－SLECTIN表达。

阳性药物为复方丹参方和阿司匹林。

2.6.5在临床上选取高血脂症患者，中医诊断符合血瘀证原则患者，观测经丹参注射液治疗后血脂、血流变，血清NO和ET－1含量变化，以及颈动脉斑块面积变化。

阳性对照药物为复方丹参方和辛伐她汀。

技术路线：

2.1基于表达谱生物信息学药靶发现：

2.2基于化学基因组学成分-靶标互相作用研究

丹参有效成分作用于血瘀型冠心病模型，采用基因芯片和蛋白质组技术分析其对基因和蛋白表达谱影响，找出差别基因及蛋白质，并通过PR-PCR、Western印迹等技术进行验证，发现该成分保护心血管分子作用通路。

进一步用丹参有效成分不同成分、不同剂量、不同比例组合依次在细胞和动物模型上对候选组合靶标进行验证，在“化学基因组学”研究技术平台层面上进行成分-靶标互相作用研究，进而验证丹参保护心血管作用组合靶标以及找到疗效确切、安全经济单体及其组合。

六、筹划进度安排

.6-.12：

丹参有效成分作用靶标筛选及生物信息学验证。

通过基因芯片及蛋白质组技术初筛得到8-15个潜在靶标，并进一步通过生物信息学筛选4-5个候选靶标。

.1-.12：

丹参有效成分作用靶标实验验证。

结合反义及siRNA技术，对候选靶标进行特异性验证，获得1-2个丹参作用靶标，针对上述靶标，研究丹参有效成分及其组合（配伍）对其表达和调控影响，获得成分与靶标互相作用实验数据。

丹参有效成分与靶标互相作用研究及验证。

通过靶标功能基因组及疾病基因组分析，设计出1-2组最佳成分组合，并在动物模型上对其药理作用及靶标表达和调控进行实验验证，获得最佳成分派伍及其作用靶标；

并归纳出丹参有效成分与靶标互相作用关系。

七、既有工作基本和条件

本研究所具备20近年从事中医中药研究经验和一支成熟科研队伍，拥有近3000平方米实验室，涉及中药制剂研究室，细胞实验室、细胞培养室（无菌室）、蛋白质组学实验室、遗传与分子生物学实验室、微生物与免疫实验室、生物化学实验室，由细胞生物学、生物化学、微生物与免疫、遗传学、分子生物学和中药制剂分析等学科支撑，是浙江省中西医结合基本重点实验室和国家中医药管理局脂代谢三级实验室以及省教委蛋白质组学重点实验室。

有配制先进实验动物房，能提供实验用清洁级实验动物。

既有正专家2人，副专家5人，其他专业技术人员20人。

可开展药物制剂，蛋白检测、生化分析等研究。

有从事本研究用有关设备，如冷冻超高速和高速离心机、蛋白液相分离层析系统、核酸电泳仪、双相电泳系统、核酸定量测定仪、紫外分光光度计、酶标仪、荧光分析仪、紫外凝胶成像系统、超净工作台、倒置荧光显微镜、超低温冰箱、液氮罐、各种培养箱等等。

本实验室与奥地利格拉茨大学生物化学研究所建有所际关系；

与德国Max-Plank生物物理研究所和中科院上海生物化学与细胞生物研究所具备良好合伙关系。

八、经费预算

九、参照文献

[1]张旭静，孔建龙，黄久仪等。

中药抗动脉粥样硬化作用研究进展。

药学实践研究22（6）321-323）

[2]林琦，陆金国，丹参抗动脉粥样硬化研究进展.山西中医　18（4）56-58）

[3]LeiXL，ChiouGCY.1986.StudiesoncardiovascularactionsofSalviamiltiorrhiza.AmJChineseMed14：

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[4]LiuGT，ZhangTM，WangBE，WangYW.1992.Protectiveactionofsevennaturalphenoliccompoundsagainstperoxidativedamagetobiomembranes.BiochemPharmacol43:

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[5]OnitsukaM，FujiuM，ShinmaN，MaruyamaHB.1983.NewplateletaggregationinhibitorsfromTan-Shen：

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[6]WuYJ，HongCY，LinSJ，WuP，ShiaoMS.1998.IncreaseofvitaminEcontentinLDLandreductionofatherosclerosisincholesterol-fedrabbitsbyawater-solubleantioxidant-richfractionofSalviamiltiorrhiza.ArteriThrombVascBiol18:

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[7]YagiA，FujimotoK，TanonakaK，HiraiK，TakeoS.1989.PossibleactivecomponentsofTan-Shen（Salviamiltiorrhiza）forprotectionofthemyocardiumagainstischemiainducedderangements.PlantaMed55:

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[8]ZhouXM，LuZY，WangDW.1996.ExperimentalstudyofSalviamiltiorrhizaonpreventionofrestenosisafterangioplasty.Chung-KuoChungHsiiChiehHoTsaChih16:

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[9]王浴生,邓文龙,薛春生.中药药理与应用.第2版.北京.人民卫生出版社,1998,191

[10]高秀梅，张伯礼.丹参及提取物对心血管系统药理作用研究进展.天津中医19

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[11]姜开余,顾振纶，阮长耿,等.丹参素对CD11b、P－selectin、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表达影响[J].中华人民共和国药理学通报,;

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[14]马增春，高月，谭洪玲，王升启.四物汤对辐射致血虚证小鼠血清蛋白质表达影响[J].中华人民共和国中药杂志，，11:

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[15]Yung-HsiangChen，Shing-JongLin，Hung-HaiKu，SalvianolicAcidBAttenuatesVCAM-1andICAM-1ExpressioninTNF-a-TreatedHumanAorticEndothelialCellsJournalofCellularBiochemistry82:

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