绿色荧光蛋白基因的克隆与表达 郭文文 0803班 11404Word文档下载推荐.docx

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CloningandExpressionofGreenFluorescentProteinGeneinE.coli

GUOWen-wen

Instructor:

WANGYou-ru

（Class0803,thecollegeoflifesciences,HubeiNormalUniversity,

Huangshi,Hubei，435002）

Abstract:

Greenfluorescentprotein（GFP）geneintherecombinantplasmidpEGFP-N3isstoredinDH5αbacteria.RestrictionenzymeBamHⅠ，NotⅠcanspecificallyidentifythegene.CuttheplasmidspEGFP-N3andpET-28awiththesameenzymesabove,respectively.Jointhetargetgeneandthelinearvector（containingthekanamycinresistancegene）usingT4ligasesothattherecombinantplasmidpET-28a-GFPwasharvested,thenrestrictionanalysiswascarriedout.AftertransformingtherecombinantplasmidintothecompetentcellBL21,sievedthepositivebacteriaintheflatscreentoinducetheexpressionofGFP.

Keywords:

greenfluorescentprotein（GFP）cloningexpressionprokaryote

引言

图1GFP的四级结构。

（罗文新,夏宁邵（译）.绿色荧光蛋白—发现、表达和发展.生物物理学报,2008,24（6）:

423.）

Fig.1ThequaternarystructureofGFP.（LUOWen-xin,XIANing-shao（translate）.Greenfluorescentprotein–discovering,expressionanddevelopment.BiologicalPhysics,2008,24（6）:

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

天然GFP含有238个氨基酸,65~67氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）可通过自身环化和氧化自发地形成一种荧光发色团。

当受到紫外或蓝光激发时，可发射绿色荧光。

GFP的晶体结构是11个β-折叠组成的桶状结构，在桶中央有一个α-螺旋。

发色基团在α-螺旋上，非常靠近桶的中心（如图1）。

[1~3]

科学家已经成功地克隆到GFP基因，它由3个外显子组成，长2.6kb。

研究证明GFP对生物体无毒无害,分子量小,方便构建载体,同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测。

作为一种生物分子标记,具有广泛的应用前景。

本实验通过基因工程的手段，将存储在质粒pEGFP-N3的GFP基因连接到载体质粒pET-28a的启动子区下游构成重组体，最后在表达菌BL-21中完成GFP基因的表达，结果成功观察到GFP发出的荧光。

当然，这只是初步验证GFP基因在非水母的生物体中可表达。

然而其意义远非如此：

绿色荧光蛋白可以帮助科学家了解细胞如何工作,比如,可以利用基因工程的手段将绿色荧光蛋白与目的蛋白融合在一起,通过绿色荧光蛋白的发光就可以看到目的蛋白的运动、定位情况。

绿色荧光蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。

[4-7]

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料

克隆菌E.coliDH-5a，表达菌BL21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a-GFP、pEGFP-N3，限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2主要实验试剂

（1）液体LB（PH7.0）

蛋白胨10g/L

酵母提取物5g/L

NaCl10g/L

（固体LB培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%。

）

（2）溶液Ⅰ（0~4℃贮存）

葡萄糖50mmol/L

Tris-Cl（pH8.0）25mmol/L

EDTA（pH8.0）10mmol/L

（3）溶液Ⅱ

NaOH0.2mol/L

SDS1%（W/V）

（用时由母液2mol/LNaOH、10%（W/V）SDS稀释现配。

）

（4）溶液Ⅲ（0~4℃贮存）

乙酸钾（5mol/L）60mL

冰乙酸11.5mL

H2O28.5mL

（5）50×

TAE电泳缓冲母液（50mL）

Tris-碱12.1g

冰醋酸2.85mL

0.5mol/LEDTA（pH8.0）5mL

（6）6×

DNA电泳缓冲液

溴酚蓝0.25%

蔗糖水溶液40%（W/V）

（7）卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用。

（8）IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用。

1.1.3主要实验仪器

SW-CJ-1FD双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、高速台式离心机、BS-1E振荡培养箱（江苏省金坛市亿通电子仪器厂）、高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）、电子天平（TE412-L、TE2101-L）、PH计、凝胶成像仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、紫外仪、恒温水浴锅。

1.2方法

1.2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建

重组质粒构建流程如图2所示，该过程由指导老师完成。

①

②②

③③

④

⑤

图2重组质粒pET-28a-GFP构建流程

碱法提取质粒；

②质粒pEGFP-N3、pET-28a双酶（BamHⅠandNotⅠ）切；

③DNA回收；

④T4连接酶连接；

⑤将重组质粒导入DH-5a中进行体内扩增。

Fig2theprocessoftheconstructionoftherecombinantplasmid

alkalineplasmidextraction;

②pET-28a，pET-28a/（BamHⅠandNotⅠ）；

③DNAreclaiming;

④JoiningbyT4ligase;

⑤InsertingtheDNAproductintoDH5αtohaveaamplificationinvivo.

1.2.2碱法提取扩增后的质粒

（1）接种大肠杆菌E.coliDH5α（含重组质粒）于LB培养液中，37℃摇床过夜培养。

（2）取1.5mL菌液于EP管中，10000rpm离心1min，离心结束后彻底弃去上清。

重复一次上述操作。

（3）往EP中加200μL溶液Ⅰ悬菌。

冰浴3min。

（4）加300μL溶液Ⅱ，盖紧EP管口，反复颠倒以混匀内容物。

（5）加入200μL溶液Ⅲ，盖紧EP管口，缓慢颠倒数次。

（6）10000rpm离心10min，取上清600μL于另一的EP管中。

加等体积氯仿缓和混合。

10000rpm离心2min，液体分层，吸取上清400μL

于另一EP管中。

（7）加无水乙醇800μL混匀后于冰上放置10min，10000rpm离心10min。

弃上清得沉淀。

（8）加入500μL70%乙醇洗管内壁。

10000rpm离心2min，弃上清得质粒。

室温风干。

（9）加灭菌水20μL溶解质粒。

冰浴保存。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳

（1）称取0.2g琼脂糖于50mL三角瓶中，加25mL1×

TBE缓冲液于三角瓶中，电热套加热至完全熔化。

（2）冷却至60℃左右。

（3）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，

（4）放入电泳缓冲液（1×

TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子。

（5）取5μL质粒溶液及1μLDNA电泳上样液混匀上样。

（6）50-100v约电泳0.5-1小时。

（7）用凝胶成像仪进行结果观察。

1.2.4酶切鉴定

（1）按表1所示酶切反应体系加样到1.5mLEP管中。

表1酶切反应体系

Table1restrictionreactionsystem

反应物

含量（μL）

质粒

BamHI

NotI

10×

bufferH

0.1%BSA缓冲液

Tritonx-100（0.1%）

ddH2O

8

0.5

2

1

6

（2）离心30s。

37℃水浴中温浴3小时。

1.2.5感受态细胞的制备及转化

（1）取-20℃保存的BL-21菌种接种到液体培养基中，37℃培养过夜。

（2）过夜菌：

LB按1:

50接种，37℃200rpm活化培养3h。

（3）将培养物移至1.5mL无菌离心管中，冰浴10min。

（4）10000rpm离心2min，彻底弃上清得菌体。

（5）加冰冷的0.1mol/LCaCl2600uL缓和悬菌，冰浴10min。

（6）10000rpm离心10min，彻底弃上清。

（7）用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液重新缓和悬菌，放置冰上待用。

（8）取100μL上述菌悬液于装有2μL质粒的EP管中。

管内各成分混匀置冰上15min。

（9）42℃热激70s，马上置冰上2min。

（10）各管加入0.4mL液体LB培养基，37℃培养60min。

（11）取200μL菌液涂于含有Kan的选择培养基，风干，37℃培养过夜。

（用完全不加质粒DNA的感受态细胞做阴性对照。

1.2.6重组GFP的诱导表达

（1）菌种活化:

从选择平板上挑取单菌落接种于4mlLB培养液（含Kan100μg/mL）中，37℃过夜摇床培养12小时。

（2）转接:

取80μL活化后的菌液接种于4mlLB培养液（含Kan100μg/mL）中，37℃摇床培养3小时。

（3）IPTG诱导表达:

400mMIPTG:

LB培养基按1:

1000诱导表达，37℃培养4小时

（4）观察蛋白表达:

用紫外线照射菌体沉淀可以看到绿色荧光。

2结果与分析

2.1质粒DNA电泳图谱

将1.2.2提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，实验结果见图3。

由于只需验证质粒是否提取成功，实验中仅对样液进行电泳，未加Marker。

图谱中有两条较清晰的条带。

带1迁移得最远，可能为共价闭合超螺旋DNA，由于带1和带2之间几乎无痕迹，带2可能是线性DNA，有拖尾现象。

开环DNA无法从图中识别。

由于电泳的时间较短（大约1h），条带不能很好的分开，但验证目的达到。

2

1

图3质粒DNA电泳图谱

Fig3GelelectrophoresisofplasmidDNA

2.2质粒pET-28a-GFP酶切鉴定结果

双酶切鉴定重组质粒的结果如图4。

3泳道中出现两条带，由于GFP基因相对于载体来说分子量很小、量很低，所以迁移速率快，电泳图谱上显示的痕迹很微弱。

123

载体

2.6kbGFP基因

图4质粒pET-28a-GFP酶切鉴定结果

Fig4RestrictionendonucleaseanalysisofplasmidpET-28a-GFP

1，2：

Marker;

3：

质粒pET-28a-GFP双酶（BamHⅠandNotⅠ）切

Lane1,2:

Lane3:

pET-28a-GFP/（BamHⅠandNotⅠ）

2.3平板筛选结果

实验组平板上长出菌落，呈白色半透明状，如图5.1，表明转化成功；

阴性对照组未出现任何反应（如图5.2），可以排除杂菌的干扰。

图5.1实验组图5.2阴性对照

Fig5.1experimentalgroupFig5.2negativecontrast

2.4GFP的荧光图谱

GFP的荧光图谱如图6。

存在于细胞中的GFP在紫外光的照射下发出绿光。

表达成功。

图6GFP的荧光图谱

Fig6FluorescentoftheGFP

3讨论

提取的质粒多以超螺旋型存在，超螺旋的质粒DNA一个螺旋由10个碱基组成，若一个螺旋大于或小于10个碱基时，分子内就产生一种力量，处于不稳定状态，当分子上有一个缺刻时，分子会立即松弛，形成开环分子，如果质粒的双链配对处都断裂则形成线性质粒。

一般提取的超螺旋质粒应占总量70%以上。

对于同一质粒，超螺旋形式体积最小，迁移速率最大；

线性DNA柔韧性最好，可以随凝胶孔径自由调整形状，但其在空间上伸展的距离最大，迁移率其次。

对于开环DNA，开环处暴露出来的支链与凝胶的阻滞力较大，且容易与线性DNA交织，迁移率最低。

酶切鉴定的结果很不明显，原因是目标基因相对于载体来说分子量很小、量很少，而电泳胶的分辨率有限。

如果凝胶上只看到一条带，根本无法判断重组质粒是否形成。

即使后面又经过平板筛选，但那可能是线性载体自身环化造成的结果（因为抗Kan基因存在于载体中），所以实际还是通过最后观察到GFP成功表达来判断重组质粒的形成。

为了解决这个问题，首先，对载体而言，应该选择至少有两个便于选择的遗传标记的载体质粒。

一个用来检测外源基因是否插入（如质粒pBluescriptSk（+/-）的白蓝斑筛选）；

另一个用于选择已把载体转化到细菌中的菌落（一般用抗生素筛选）。

其次，若载体只有一个标记，如本实验的载体质粒pET-28a，通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化。

绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多,且不会受自发荧光的太大影响。

因此,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻（甚至小麦、玉米）转基因研究中的报告基因。

将GFP表达质粒导入BHK、DK、RK等真核细胞,建立真核细胞转基因指示系统,结果表明,GFP的表达对胚胎无损伤,又经济简便,可避免半乳糖苷酶等报告基因的不足,是提高基因转移与筛选效率的理想途径[8]。

由此可知，本实验中的重组质粒pET-28a-GFP（可能要经过人工改造）同样可作为载体，在GFP基因处接受外源基因。

GFP基因可发挥类似于LacZ基因（用于蓝白斑筛选）的功能，且效果更好。

GFP近几年得到了广泛的应用与发展,成为各研究领域的宠儿,但由于基础理论研究远不及应用研究,因而其存在着一些问题与不足,如检测的灵敏度还有待进一步提高;

荧光强度的非线性性质使其定量非常困难;

新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式,程十分缓慢;

紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用;

多数生物具有微弱的自发荧光现象,并有着类似的激发和发射波长,干扰某些GFP的检测等。

考虑到上述问题与不足,GFP如在各领域得到更加完整全面的应用,至少还需要几个条件:

基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的融合。

与此同时,随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟,我们有理由相信,GFP一定会给我们带来更多的应用价值,并进一步揭开生命的未解之谜[9]。

4参考文献

1．朱昀,李朝炜.绿色荧光蛋白.生物学教学,2010,35（6）:

62.

2．KatharineSanderson.2008年诺贝尔化学奖成果:

绿色荧光蛋白的研究.分子植物育种:

62.

3．绿色荧光蛋白助推20世纪生物学革命.sciencein24hours:

12.

4．何海健,陈婷飞.绿色荧光蛋白及其在分子生物学上的应用.金华职业技术学院学报,2008,8（4）:

26~29.

5．崔兴国.绿色荧光蛋白在现代生物学研究中的应用.应用科技：

73~74.

6．段青,王倩,祁庆生.绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用.生命的化学,2007,27

（1）:

48~50.

7．罗文新,夏宁邵（译）.绿色荧光蛋白—发现、表达和发展.生物物理学报,2008,24（6）:

423

8．张雨丽,张桂征,苏红梅,蒙艺英,闭立辉.绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用生物技术通报,2010,9:

16~19.

9．吴沛桥,巴晓革,胡海,赵静.绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用.生物医学工程研究,2009,28

（1）:

83~86.

致谢

本综合性实验周期较长，感谢王老师的耐心指导以及同组的褚靖、王盼的密切配合，使得实验较圆满地完成。

同时感谢肖喜林、徐太勇对论文的仔细阅读和修改并提出宝贵意见和建议。