荧光探针Word文档格式.docx

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核酸探针；

Ph值探针；

免疫荧光探针；

钙离子探针；

活性氧探针。

细胞活性探针是标记活细胞；

酯酶底物探针、过氧化物酶底物探针和离子泵活性指示探针识别死细胞，死细胞探针有膜不透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。

而其优点是灵敏，安全。

细胞器探针是与细胞器选择性结合的荧光染料。

主要用途：

研究胞内的氧化作用、有丝分裂、底物降解作用、解毒反应、细胞间的转运和细胞分拣等。

膜探针是非极性探针、两性探针、膜流动性探针、荧光标记的磷脂、脂肪酸和固醇探针。

用途：

测量膜的扩散、监测病毒－细胞的融合、观察膜流动性和研究膜表面的分子组成。

核酸是细胞生长、分化、遗传的重要物质。

测定DNA和RNA的形态和含量；

研究细胞周期和肿瘤的诊断、治疗和预防。

（二）一些荧光探针热点的实例

1：

小分子荧光探针

小分子荧光探针一般由两部分组成：

荧光团以及与受体专一性高亲和力结合的配体。

受体与目标蛋白质融合，通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。

总体说来，小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；

能够与受体专一性稳定结合，使得其在进行监测的较长时间（几个小时）内保持稳定性；

背景噪音水平尽可能的低；

探针尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便地结合。

选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。

对于受体的选择有以下两个要求：

（1）受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达；

（2）受体应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。

而选择适合的受体-配体对可以实现对蛋白质高灵敏度高亲和力结合。

一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，有利于监测时间敏感性的生理过程。

受体-配体的作用一般包括半抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、酶-底物、联砷荧光物质与富含半胱氨酸的肽链之间的作用等。

小分子荧光探针又有一下几种。

1.1FLAsH型探针。

Tsien等提出了一种将荧光素的衍生物在活体细胞内与蛋白质位点专一性共价结合的新方法。

Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys序列（Xaa是非Cys的任意氨基酸）融合或插入到目标蛋白质中，具有细胞膜通透性的联砷-荧光素衍生物与序列专一性地识别，在每个砷原子与两个半胱氨酸的巯基共价结合后发出荧光。

FLAsH能够很方便地在钯催化的条件下，通过三氯化砷与荧光素的醋酸汞盐的转金属化作用一步得到，而且通过加入1,2-乙二硫醇（EDT）很好地加以分离，得到没有荧光的产物FLAsH-EDT2。

但是当与砷原子共价结合的EDT被Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys序列中的巯基替代后，荧光强度增强约50000倍。

FLAsH-EDT2的荧光淬灭可以用震动失活或光诱导的电子转移机理来解释，而结构较为固定且刚性较大的多肽链能阻止荧光的淬灭。

此外，除了绿色的FLAsH，红色的ReAsH和蓝色的HoXAsH、CHoAsH等多种衍生物已被成功合成。

Vogel等提出了一种新型的小分子探针，由两部分组成，一部分为荧光基团，另一部分为螯合物，由金属离子与含有三醋酸根的叔胺类化合物组成（NTA）（图式2）。

这种探针能够可逆、专一性地与目标蛋白质的寡聚组氨酸序列结合。

Vogel等用Ni-NTA标记在N端含有六聚组氨酸序列的GFP（GFP-His6）。

两者的结合在几秒钟之内即完成。

Ni-NTA作为理想的FRET受体几乎完全淬灭了GFP的荧光。

而且此反应的速度与Ni-NTA探针的浓度成正比关系，表明Ni-NTA与GFP-His6结合的比例系数为1：

1。

特别要指出的是，Ni-NTA探针都是通过淬灭与目标蛋白质连接的受体的荧光间接使用的。

这是由于对与Ni-NTA直接相连的荧光基团的荧光成像相当困难，因为Ni2+会淬灭荧光并且Ni-NTA与寡聚组氨酸序列之间的亲和力并不是特别高。

同样是以氨基酸序列作为受体，这种探针优于FlAsH的地方是它可以用于氧化环境中。

1.2AGT型探针

Johnsson等利用人类DNA修复蛋白的6-О-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT）的特性，提出了一种新的蛋白质荧光标记方法。

AGT的氨基酸残基能识别6-О-烷基鸟嘌呤，并且将烷基转移连接到自身的一个半胱氨酸的巯基上。

AGT的底物识别性很广，能够识别很多种类的烷基，包括苯甲基。

Johnsson等先将目标蛋白质与hAGT融合，鸟嘌呤衍生物与作为标签的荧光团结合作为探针，hAGT半胱氨酸上的活性硫原子亲核进攻以苯甲基修饰的鸟嘌呤衍生物来完成两者间的结合（图式3）。

由于苯甲基鸟嘌呤与hAGT之间存在共价作用，结合比较稳定，可以在数小时内对hAGT融合蛋白进行观察。

只有探针诱导的细胞内融合蛋白质降解对此过程有影响。

由于hAGT与GFP相比，体积小31个氨基酸，因此对目标蛋白质的影响也大大减少。

苯甲基鸟嘌呤的衍生物较多，到现在为止，已有20多种能够与AGT进行专一性标记，这是使用AGT标记方法的一个优势。

然而值得注意的是，在哺乳动物的细胞中，内源的野生型AGT（wtAGT）也会被苯甲基鸟嘌呤的衍生物识别，从而出现较高的背景标记。

为了解决这一缺陷，Johnsson合成了一种wtAGT的抑制剂和一系列能抵抗此抑制剂的AGT变体。

这样就能使得在这种抑制剂的存在下，wtAGT失活，而AGT变体能够对目标蛋白质进行专一性标记。

这种利用AGT变体和wtAGT抑制剂的方法有许多优势，例如组成AGT变体的氨基酸数为182，与hAGT（207）相比有所减少；

另外AGT变体对于烷基化的DNA的亲和力低于hAGT,从而专一性得到提高，背景值得到降低。

总的说来，AGT及其变体对蛋白质进行标记具有专一性和很广的底物识别性，但是它的体积仍然较大，这是这种方法的一种内在缺陷。

1.3HaloTag型探针

普洛麦格公司（Promega）的研究者利用脱卤素酶（HaloTag）的特性提出了一种在思想上与AGT融合蛋白质相似的新的蛋白质标记方法。

野生型HaloTag能够与卤代的脂肪族化合物发生两步反应：

HaloTag先发生亲核取代反应，脂肪族底物与天门氨酸盐形成酯（图式4），接着酯水解生成醇作为最终产物。

这种方法专一性较好，然而HaloTag由293个氨基酸组成，体积比GFP大。

根据类似的思想，利用一段短的肽链作为受体，可以设计出一些新型的小分子荧光探针。

1.4PCP、ACP型探针

Yin和George提出了一种新的方法，这种方法是基于含有多肽链的蛋白质（PCP）或是含有酰基的蛋白质（ACP）在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPtase）的催化作用下对蛋白质进行专一性标记。

PPtase将磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A（CoA）上转移至ACP或PCP的一个精氨酸侧链上，形成专一性的共价结合。

这种方法已经被应用于在酵母菌和哺乳动物细胞中荧光标记α-凝集素受体（Aga2p）和人类Ｇ-蛋白结合的受体（NK1）。

这种探针具有较多的优点：

标记速度较快；

体积小，约由80个左右的氨基酸组成；

对于不同种类的CoA衍生物，PPtase缺乏分辨力，因此可以应用多种标记方式。

2：

双光子金属离子荧光探针

在各种生物学过程中,少量的金属离子如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+等对于许多重要细胞的生长生存、功能调节及体内生物活性酶的催化等都起着非常重要的作用[1-5],因此对其识别和检测具有重要的意义。

荧光探针法用于检测金属离子具有方便、快捷和灵敏度高的特点。

双光子金属离子荧光探针常用的有一下几种。

2.1　钙离子双光子荧光探针

Kim等人[15]合成了荧光团是1-氰基-2,5-双苯乙烯基苯的衍生物,受体是单氮杂15-冠醚-5的钙离子荧光探针1。

该探针荧光量子产率为0.47,激发波长740nm下甲苯中双光子吸收截面和络合常数分别为320GM和pK=4.26±

0.06,乙腈中要小得多。

其作用机理是当氮杂15-冠醚-5螯合Ca2+时,氮杂氮原子上的孤对电子与Ca2+配位成键,使荧光团上的分子内电荷迁移减弱,导致单光子与双光子吸收及荧光特性上发生变化,吸收和发射强度均减弱,且发生相应的蓝移。

然而,该探针对钙离子没有专属性,对Ba2+、Mg2+、Na+和K+也有不同程度的络合。

到目前为止,以冠醚为受体的双光子荧光探针被大量报道,虽然其对碱金属离子和碱土金属离子敏感性很强,但其对金属离子的专属选择性不好,总是受其它离子的干扰。

2002年,Marcotte等人[16]合成了D-A-D型的钙离子探针2,其非线性光学性质在光电子方面具有广泛的应用。

激发波长为708nm时,探针2在464nm具有最大吸收,在562nm有最大发射,荧光量子产率为0.14,与钙离子络合后,吸收峰蓝移至375nm,最大发射峰红移至583nm,荧光量子产率降低至0.057。

Kim等人[17]以萘的衍生物为荧光团合成了探针3~探针5。

它们对钙离子具有高度的敏感性,激发波长为780nm时,与钙离子络合后荧光强度增加23~50倍,络合常数在（0.14±

0.02）~（0.25±

0.03）μM范围内,在大于100μm深度的血管中能检测到钙离子的信号,并且没有光漂白问题。

2.2　锌离子双光子荧光探针

Ahn等人[18]以均二苯乙烯为荧光团,二-（2-吡啶）胺为受体合成了探针6,激发波长为780nm时,探针6拥有很强的双光子荧光。

与锌离子络合后,由于分子内电荷转移的影响使荧光强度降低。

但是Pb2+,Co2+,Ba2+对探针6都有一定的络合性,尤其是铅离子,对锌离子的检测干扰更大。

Bozio等人合成了探针7[19],此探针受体对过渡金属离子具有很强的选择性,尤其是对锌离子。

在519nm处有最大吸收,当探针和Zn2+络合后,吸收光谱发生红移,光谱峰变宽。

当过量的Zn2+加入以后,在548nm处荧光有最大发射,Zn2+加入前后荧光量子产率分别为0.31和0.35。

虽然探针7对Zn2+络合能力不是很强,但是实验处理比较容易,因此也为锌离子探针的合成奠定了一定的基础。

黄飞等人[20]合成了探针8,探针8是一个新型的交替共轭聚合物分子,由于其结构的特殊性,当与锌离子络合后,荧光强度及荧光发射峰表现出明显的变化,因此可以应用在双光子荧光显微镜中。

探针8具有D-π-D结构,在四氢呋喃溶剂中双光子吸收截面高达1440GM。

在激发波长800nm下,随着锌离子的加入,发射光谱发生红移,当锌离子浓度大于5.1×

10-6mol/L,物质与锌离子作用已经达到饱和,荧光光谱淬灭。

但是此探针的专属性并不好,受到Mg2+和Ca2+的干扰。

Chang等人[21]合成了探针9,激发波长为760nm时,与锌离子络合前,在500nm有最大吸收,摩尔消光系数为8.1×

104M-1cm-1,516nm有最大发射,荧光量子产率为0.03。

与锌离子络合后,吸收和发射光谱都发生蓝移,荧光量子产率增加了11倍,为0.35。

此探针对锌离子的选择性优于对钙离子和镁离子的选择性,分离常数小于1nM。

2009年,陈晓云[22]等人合成了探针10,激发波长为800nm时,在中性缓冲水溶液中,其对锌离子有高的敏感性和选择性,与锌离子络合后,荧光强度增加了14倍,当pH大于5时,探针10与饱和的锌离子络合后,荧光强度不再发生变化,因此在生理pH变化范围内可以检测细胞内锌离子浓度,生理系统中含有丰富的Ca2+,Mg2+和K+,然而在荧光发射中观察不到这些阳离子的影响,所以在生物细胞双光子成像中探针10具有广泛的发展前景。

2.3　镁离子双光子荧光探针

由于D-A-D结构的荧光团拥有大的双光子吸收截面,而冠醚类受体对碱金属和碱土金属离子具有很强的敏感性和络合性,基于上述优点,Pond等人合成了探针11和探针12。

双光子激发波长均为810nm。

冠醚中的氮原子与镁离子络合后,氮原子给电子的能力降低,由于分子内电荷转移,双光子吸收峰的位置和强度受到很大的影响。

探针11和探针12的双光子吸收截面分别为1800GM、2150GM,当与镁离子络合后,双光子吸收截面变小。

探针11与镁离子络合常数为3500M-1,比以往报道的以氮杂-15-冠醚-5为受体,其它化合物为荧光团的络合常数都大。

由于探针12连接着两个冠醚受体,因此和镁离子结合有两种情况:

探针12:

Mg2+,探针12:

2Mg2+,由于第一个镁离子与受体氮原子络合后,分子另一端氮原子的电子云密度降低,与第二个镁离子作用就会减弱,所以络合常数k12比K11要小。

但是此探针的水溶性很差,在水中不能络合镁离子,在选择性性上也有缺陷。

2006年,Kim等人[24]合成了探针13。

此探针具有很好的水溶性,在水中的溶解度为3.0×

10-6M。

在880nm波长激发下,与镁离子络合后,与fura-2与镁离子络合相比[24],荧光强度增加了20倍,吸收光谱和发射光谱均发生红移。

探针13的荧光强度不受碱金属离子,过渡金属离子的影响。

但此探针对pH比较敏感,只有在pH大于6.5,荧光强度才不发生变化。

钙离子和该探针也有结合作用,但镁离子结合后荧光强度比与钙离子结合后荧光强度增加了6.5倍,因此,此探针可以在细胞中检测镁离子而不受钙离子的干扰。

3：

量子点荧光探针

量子点是由半导体材料（通常由元素周期表的II~VI,III~V或IV~VI族原子）制成的尺寸在1~12nm的微粒·

由于量子点的特殊结构导致了它具有表面效应、量子尺寸效应、介电限域效应和量子隧道效应,从而派生出许多不同于宏观块体材料的物理化学性质和独特的发光特性[9]。

作为新型荧光探针的量子点具有发射量子产率高、光漂白性能不明显、荧光强度高及稳定性好等的荧光性质。

同时量子点（图1）相比传统荧光染料分子激发光谱宽且连续;

发射荧光光谱峰狭窄而对称。

更有趣的是,量子点的发射谱线具有“调频”能力。

其发射峰波长不但会随着量子点的核心材料变化而变化,还会随着量子点的尺寸大小而改变。

以CdSe量子点为例:

当CdSe量子点的直径为2nm时,能发射出550nm的绿色光,当直径增大到4nm时,则变成了630nm的红色光。

这样就给荧光标记法带来了很大的便利:

我们可以用多种不同量子点同时进行标记,而且以同一种光源进行激发,其发射的谱线不容易重叠,有利于我们进行多组分同时测定。

但量子点的这种“调频”能力,也要求作为标记物的量子点必须有分布均一的粒径,这给我们制备量子点探针时带来很大的困难。

类似于传统荧光探针分析法,将小分子或离子被测物引入量子点表面,会增大量子点荧光强度或猝灭荧光。

这是因为:

量子点荧光受其表面结构影响巨大。

由于引入的分析对象会与量子点发生物理、化学作用,从而改变量子点表面的电荷和组成,甚至会引起核心电子空穴的重组,影响荧光强度。

其强度的改变量会随着被测物浓度变化,它们的关系可用荧光猝灭方程或荧光加强效应方程来描述。

鉴于以上原理,可以将量子点用于分析当中·

不同于传统的荧光探针分析法,量子点荧光探针分析的选择性与探针本身的关系不大,而与对量子点改性的表面物质有关。

种镉基量子点经过不同的表面改性后可对不同的物质选择性的进行分析。

Rosenzweig]等发现:

以1-巯基甘油为稳定剂的CdS量子点与Cu2+离子作用后会发生荧光猝灭；

以L-半胱氨酸为稳定剂的量子点与Zn2+离子作用后会产生荧光增强。

并且首次将量子点成功地应用于这两种金属离子的分析当中。

Kerim[31]等则设计了一段5个氨基酸序列的五肽,并以此五肽为稳定剂合成了CdS量子点,根据荧光猝灭或荧光增强可分别用于Cu2+和Ag+离子的检测。

Isa-rox[32]等以CdS量子点测定Cu2+离子。

他认为:

Cu2+离子处于CdS量子点表面时会被迅速地还原为一价Cu+离子。

而一价Cu+离子会引起量子点内核导带中激发态电子与价带中空穴产生重组,导致量子点的荧光猝灭,同时还会使得量子点发射峰红移。

Costa-Ferná

ndez等采用以2-巯基乙酸进行表面处理过的CdSe量子点测定Cu2+·

结果显示共存离子Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Mn2+和Co2+对测定不会产生干扰;

Fe3+离子的干扰可加入NaF使其形成FeF3-6去除;

而Ag+和Hg2+离子将会影响测定结果。

但是由于Ag+和Hg2+离子产生的荧光猝灭信号远远小于Cu2+离子,只要它们的浓度不高于1g/L,干扰可以忽略。

就能实现高灵敏度、高选择性测量溶液中的Cu2+。

Li等采用半胱胺酸包裹的CdTe量子点分别与不同的金属离子作用·

发现200μmol/L的Zn2+使荧光有4%的增强,而同样浓度的Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+等离子分别有4%,12%,54%,84%荧光减弱。

Zn2+离子与CdTe量子点之间的荧光增强作用附合Lang-muir吸附模式,Co2+离子对CdTe量子点荧光的猝灭作用附合Stern-Volmer方程模式。

LiHaibin等发现以硫化杯芳烃包裹的CdSe/ZnS量子点荧光可以不受Mg2+,Ca2+,Cu2+,Zn2+,Mn2+，Co2+,Ni2+等离子的干扰选择性的测量Hg2+·

首次从方法上根本的消除了Cu2+对Hg2+测定的干扰。

4:

硫醇类荧光探针

硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。

小分子硫醇包括半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、硫辛酸和辅酶A；

大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。

大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。

谷胱甘肽（GSH）是细胞内含量最高的小分子硫醇（1—10mmol／L），它存在氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型GSH的氧化还原动态平衡。

大量资料显示，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。

因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。

目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：

高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。

荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。

利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物。

马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH5～8时几分钟即可完成。

Kanaoka等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物，并于1970年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂1。

试剂1是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂，缺点是激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。

经过对荧光发射团系统的研究后，Machida等又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂2。

试剂2的激发和发射波长分别为400和480nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团。

试剂1和2被称为Kanaoka试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点。

近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的GSH、Cys等具有重要生物学意义的小分子硫醇。

1995年Langmuir等设计合成了5个以苯并香豆素（naphthopyranone）为母体荧光团的氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针4—8，这些探针与一些小分子硫醇如GSH、Cys等在生理pH条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定。

他们将这5个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针3比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大（其中试剂8荧光量子产率变化最大，0．012～0．66），是比试剂3（0．021—0．13）更为灵敏的探针。

Liang等组设计合成探针5-maleimidyl-2-（in．methylphenyl）benzoxazole（MMPB），与其它马来酰亚胺类探针相比，由于MMPB—GSH和MMPB—Cys荧光性质的不同，该探针可以实现对GSH和Cys的选择性响应。

在激发和发射波长分别为299．2和355．8nnl时，MMPB可以选择陛的检测GSH，在含有0．4倍的Cys的情况下对GSH的检出限可达3．23×

10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。

该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中GSH含量的测定；

在激发和发射波长分别为305．6和425．6nln时，MMPB还可选择性的检测Cys。

在同时存在0．15倍的GSH的条件下对Cys的检出限可达6．2×

该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中Cys的测定，回收率高、重现性好。

该探针虽然可以实现对GSH和Cys的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大。

该课题组2005年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针9啪J，激发和发射波长分别为401和496nm。

试剂9用于检测Cys线性范围1．0×

10-8～6．0×

10-7moL／L，检出限5．7×

10-9moL／L；

检测GSH线性范围6．0×

10-9～4．0×

10-7mol／L，检出限5．64×

10-9moL／L。

试剂9被成功应用于检测人血清和血浆中的GSH，人尿液中的Cys，回收率96．2％一103．0％。

试剂9用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35℃时15min即可反应完全，且与前一个探针MMPB相比波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。

5:

纳米荧光探针

21世纪是高新技术的世纪，信息、生物和新材料代表了高新技术的发展方向。

在信息产业如火如荼的今天，新材料领域有一项技术引起了世界各国政府和科技界的的高度关注，这就是——纳米科技。

处于新材料科技前沿的纳米技术最近几十年取得了前所未有的发展，将会掀起新一轮的技术浪潮，领导下一场工业革命，人类也将进入纳米科技时代。

而纳米材料的研究，是一个高度交叉的综合性学科，包括物理、化学、生物学、材料科学和电子学。

它不仅包含以观测、分析和研究为主线的基础学科，同时还有以纳米工程与。

纳米材料和技术是纳米科技最富活力、研究内涵最丰富的学科分支。

荧光纳米粒子作为一种荧光探针已被广泛应用在生物标记及医疗诊断领域。

近年来国外已涌现出多家研制和开发荧光纳米粒子生物荧光标