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性物质和易氧化物质的分离；

（3）传热速率快，温度易于控制；

　（4）适合于挥发性物质的分离

二．高效液相色谱法（HPLC）

反相柱（流动相极性大于固定相）——极性大的先流出C18

正相柱（流动相极性小于固定相）——极性小的先流出硅胶

1.高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

2.高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。

对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。

因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

3.HPLC与经典液相色谱相比有以下优点和缺点：

速度快——通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

缺点：

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。

在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。

高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

4.组成：

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。

检测系统：

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。

其特点：

使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；

灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；

线性范围宽；

对温度和流速变化不敏感；

可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。

，糖类化合物的检测使用此检测系统。

这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。

因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

5.测定方法

　　定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。

但用归一法或内标法测定杂质总量时，须采用峰面积法。

面积归一化法　

　　测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。

计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。

但溶剂峰不计算在内。

色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外,可为该品种项下主成分保留时间的倍数。

主成分自身对照法

　　当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。

在测定前，先按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。

然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。

根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。

内标法

测定供试品中杂质的总量限度

　　采用不加校正因子的峰面积法。

取供试品，按各品种项下规定的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图Ｉ；

再配制含有内标物质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图Ⅱ。

记录的时间除另有规定外，应为该品种项下规定的内标峰保留时间的倍数，色谱图上内标峰高应为记录仪满标度的30％以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。

　　如果色谱图Ⅰ中没有与色谱图Ⅱ上内标峰保留时间相同的杂质峰，则色谱图Ⅱ中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积（溶剂峰不计在内）。

如果色谱图Ⅰ中有与色谱图Ⅱ上内标物质峰保留时间相同的杂质峰，应将色谱图Ⅱ上的内标物质峰面积减去色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面积；

色谱图Ⅱ中各杂质峰总面积加色谱图Ⅰ中此杂峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。

　　加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量

　　按各品种项下的规定,精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

　　As／ms]校正因子f＝-Ar／mr式中As为内标物质的峰面积或峰高，Ar为对照品的峰面积或峰高；

ms为加入内标物质的量,mr为加入对照品的量。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品（或其杂质）峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

Ax含量（mx）＝f×

-As／ms式中Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；

mx为供试品（或其杂质）的量。

f、As和ms的意义同上。

　　当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。

外标法　测定供试品中某个杂质或主成分含量

　　按各品种项下的规定,精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：

　　A<

[x]>

含量（mx）＝mr×

-Ar式中各符号意义同上

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好

三．气相色谱法（gaschromatography简称GC）

1.气相色谱是一种物理的分离方法。

利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。

2.特点：

气相色谱法具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。

3.组成：

由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。

进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。

3.1柱箱：

色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。

由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器，因此进样器和检测器的下端（接头）均插入柱箱。

柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱，并且操作方便。

色谱柱（样品）需要在一定的温度条件下工作，因此采用微机对柱箱进行温度控制。

并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。

对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。

且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。

3.2进样器：

进样器的作用是将样品送入色谱柱。

如果是液体样品，进样器还必须将其汽化，因此采用微机对进样器进行温度控制。

根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种进样器可供选择：

1）.填充柱进样器

2）.毛细管不分流进样器附件

3）.毛细管分流进样器附件

4）.毛细管分流/不分流进样器

5）.六通阀气体进样器

3.3检测器:

检测器的作用是将样品的化学信号转化为物理信号（电信号）。

检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作，因此采用微机对检测器进行温度控制。

根据各种样品的化学物理特性，共有五种检测器可供选择：

1）.氢火焰离子化检测器（FID）

2）.热导检测器（TCD）

3）.电子捕获检测器（ECD）

4）.氮磷检测器（NPD）

5）.火焰光度检测器（FPD）

3.4数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

4.定量方法可分以下三种：

1）、内标准法取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制标准溶液。

分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积和峰高和内标物质的峰面积和峰高的比例为纵座标，取标准被测成分量和内标物质量之比，或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。

然后按单体中所规定的方法调制试样液。

在调制试样液时，预先加入与调制标准液时等量的内标物质。

然后按制作标准曲线时的同样条件下得出的色谱，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰积或峰高之比，再按标准曲线求出被测成分的含量。

　所用的内标物质，应采用其峰面积的位置与被测成分的峰的位置尽可能接近并与被测成分以外的峰位置完全分离的稳定的物质。

2）绝对标准曲线法[1]取标准被测成分按依次增加或减少阶段法，各自调制成标准液，注入一定量后，按色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高为纵座标，而以标准被测成分的含量为横坐标，制成标准曲线。

然后按单体中所规定的方法制备试样液。

取试样液按制标准曲线时相同的条件作出色谱，求出被测成分的峰面积和峰高，再按标准曲线求出被测成分的含量。

3）峰面积百分率法以色谱中所得各种成分的峰面积的总和为100，按各成分的峰面积总和之比，求出各成分的组成比率。

四．薄层色谱法

　1.　薄层色谱，或称薄层层析（thin—layerchromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。

这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。

2.基本原理

　　薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板（常用玻璃板，也可用涤纶布等）上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。

薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

　　吸附是表面的一个重要性质。

任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。

在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

　　物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子（离子或原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等。

在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。

而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。

吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。

在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。

吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

　　例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。

当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。

如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

3.方法：

制造硅胶板——点样——展开——紫外灯下检视——对照

4.层层析有许多优点：

它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；

混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0．01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。

薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。

五．柱色谱法又称柱层析

　1.柱层析技术也称柱色谱技术。

一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。

在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。

2.柱色谱法又称柱层析。

固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。

它既区别于用于分离分析的GC和HPLC法，也区别于样品在平面形固定相内移动的纸层析和薄层色谱法。

本法主要用于分离，有时也起到浓缩富集作用。

在环境分析测试中，本法广泛用于样品的前处理，如在水和气溶胶的有机污染分析中，将萃取液转移到层析柱内，而后用环己烷洗脱烷烃部分，用苯洗脱多环芳烃类污染物，用乙醇洗脱极性组分；

在土壤分析中，用氧化铝柱捕集分离稀土元素钍、铊等。

　　吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。

当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。

当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；

或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

柱色谱法columnchromatography将色谱填料装填在色谱柱管内作固定相的色谱方法。

根据色谱柱的尺寸、结构和制作方法的不同，又可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱。

六．紫外分光光度法

工作原理

　　许多有机化合物在紫外区具有特征的吸收光谱，因此可用紫外分光光度法对有机物质进行定性鉴定，结构分析及定量测定．紫外分光光度法定量测定的依据是比耳定律。

首先确定化合物的紫外吸收光谱，确定最大吸收波长。

在选定的波长下，作出化合物溶液的工作曲线，根据在相同条件下测得待测液的吸光度值来确定待测液中化合物的含量。

　　物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。

由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

　　紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。

即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比

2.可见-紫外分光光度计。

其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。

主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。

七．红外光谱法

1.红外光谱法又称“红外分光光度分析法”。

简称“IR”,分子吸收光谱的一种。

利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及对各种吸收红外光的化合物的定性和定量分析的一法。

被测物质的分子在红外线照射下，只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱。

对红外光谱进行剖析，可对物质进行定性分析。

化合物分子中存在着许多原子团[1]，各原子团被激发后，都会产生特征振动，其振动频率也必然反映在红外吸收光谱上。

据此可鉴定化合物中各种原子团，也可进行定量分析。

2..红外光谱法的一般特点

　　特征性强、测定快速、不破坏试样、试样用量少、操作简便、能分析各种状态的试样、分析灵敏度较低、定量分析误差较大

3．对样品的要求

　　①试样纯度应大于98％，或者符合商业规格

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Oslash;

这样才便于与纯化合物的标准光谱或商业光谱进行对照

多组份试样应预先用分馏、萃取、重结晶或色谱法进行分离提纯，否则各组份光谱互相重叠，难予解析

　　②试样不应含水（结晶水或游离水）

水有红外吸收，与羟基峰干扰，而且会侵蚀吸收池的盐窗。

所用试样应当经过干燥处理

③试样浓度和厚度要适当，使最强吸收透光度在5～20%之间

八．凝胶色谱法（凝胶层析法）（蛋白质相对分子质量的测定）

1.凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。

GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。

化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对勿子质量分布测试。

2.凝胶色谱法基本理论

（一）分子筛效益

　一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：

垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

具有多孔的凝胶就是分子筛。

各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。

分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻[1]。

两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。

直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。

如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。

因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。

综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；

二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；

三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。

大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。

对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：

分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。

于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。

另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。

分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。

（二）色谱柱的重要参数

　　⑴柱体积：

柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。

在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt表示。

　　⑵外水体积：

色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。

　　⑶内水体积：

因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总