大鼠IL10基因真核表达质粒的构建及其在BRL细胞中的表达Word文档下载推荐.docx
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受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因医治肝纤维化的有效转染载体。
【关键词】白细胞介素-10基因医治去唾液酸糖蛋白受体肝细胞
［Abstract］AIM:
ToconstructeukaryoticexpressionvectorofratIL-10geneandobserveitsexpressioninhepatocytecelllineBRL.METHODS:
TotalRNAwasextractedfromratperipheralbloodmononuclearcells.ThefulllengthcodingregionofIL-10wasamplifiedbyRT-nestedPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvector.TherecombinantplasmidwastransfectedintoBRLcellswitheitherliposomeTransfastTMorasialoglycoproteinreceptormediatedliposomePEIjet-galrespectively.TheexpressionofIL-10mRNAwasdetectedwithPCRandthatofIL-10secretedfromBRLcellstransfectedbyliposomePEIjet-galwasdetectedwithELISA.RESULTS:
TherecombinantplasmidwasidentifiedandconfirmedwithdigestionofrestrictionendonucleaseandDNAsequencing.ReceptormediatedliposomePEIjet-galexhibitedsignificantlyhighertransfectionefficiencythanliposomeTransfastTMandhigherlevelsecretoryIL-10expressedinBRLcells.CONCLUSION:
TheeukaryoticexpressionvectorofIL-10genewassuccessfullyconstructed.Asialoglycoproteinreceptor-mediatedliposomehadhightransfectionefficiencyonhepatocytes,suggestingthatitcouldbeapotentialhepatocyte-targetingdeliverysystemforIL-10genetherepy.
［Keywords］interleukin-10;
genetherapy;
asialoglycoproteinreceptor;
hepatocyte
肝纤维化是多种慢性肝病进展为肝硬化的一起病理进程。
白细胞介素-10（IL-10）是一种具多效性的细胞因子,在肝纤维化的进程中扮演重要的负反馈角色［1］。
引入外源性IL-10也被证明对肝纤维化有拮抗作用［2］。
可是由于重组IL-10半衰期很短,难以在体内维持一个相对稳固的浓度;
静脉用药,其作用缺乏肝脏靶向性。
而探讨通过适合途径进行IL-10的基因医治,那么有可能解决上述问题,具有必然的应用前景。
本实验中构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,并通过受体介导的脂质体和非受体介导的脂质体转染大鼠肝细胞系BRL,观看IL-10的表达情形,比较2种有无受体介导的脂质体的转染效率,为下一步IL-10基因医治肝纤维化的动物实验奠定了基础。
1材料和方式
材料真核表达载体由福建省消化研究室保留;
逆转录酶购自Fermentas公司;
高保真Taq酶、限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4连接酶均购自Promega公司;
质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;
胶回收试剂盒购自上海中科开瑞生物芯片科技;
PEIjet-gal转染载体购自polyplus公司;
TransfastTM脂质体购自Promega公司,RNA抽提试剂盒购自Gentra公司;
大鼠IL-10ELISA试剂盒购自Biosource公司;
BRL是永生化的正常大鼠肝细胞系引自中国科学院上海细胞库。
方式
大鼠IL-10基因的获取取SD大鼠外周血5mL,以Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,用RNA抽提试剂盒按说明书抽提总RNA,并逆转录为cDNA作为模板,设计两对引物,用巢式PCR方式扩增出IL-10的全长编码序列（包括信号肽与功能肽）。
外侧引物别离位于IL-10编码序列两头的外侧,其扩增产物将作为内侧引物的模板;
而内侧引物恰位于编码序列两头,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点和Kozak序列。
外侧引物序列:
上游5′-cgcagccttgcagaaaacagagc-3′,下游5′-gctctatttatgtcctgcagtccag-3′,产物片段为606bp;
内侧引物序列:
上游5′-cgaagcttgccaccatgcttggctcagcac-3′,下游5′-cgtctagatcaatttttcattttgagtg-3′,产物片段为559bp。
后者扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,切下目的片段,用胶回收试剂盒提取目的DNA。
重组质粒的构建与鉴定上述目的片段与空质粒均用HindⅢ和BamHⅠ酶进行双酶切,酶切条件为:
整体系20μL,含10×
酶切缓冲液2μL,BSA2μg,DNA1μg,HindⅢ5U,BamHⅠ5U,37℃4h。
酶切产物各自在琼脂糖凝胶上电泳,用胶回收试剂盒提取较长片段。
目的基因和质粒的回收片段按浓度比3∶1混合,加入T4连接酶,4℃留宿。
以连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,并接种于氨苄青霉素阳性培育液。
24h后用接种针挑取部份菌落作为模板,用IL-10内侧引物进行菌落PCR,对扩增出IL-10的菌落之一进行增菌培育,用质粒回收试剂盒按说明书抽提质粒,用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。
并将重组质粒送测序鉴定（委托Invitrogen公司进行）。
PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体对BRL细胞转染效率的比较转染前24h调整细胞数,将BRL细胞接种于6孔板中,使转染时细胞铺满孔底的50%~60%。
别离用PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体将重组质粒转染BRL细胞24h,并于转染终止即时及以后一、二、4、八、1二、16d用RNA抽提试剂盒抽提各组细胞的总RNA,用RT-PCR方式检测IL-10的mRNA表达,设立β-actin为内参照,IL-10引物为上述的内侧引物,β-actin引物序列:
上游5′-ccaaccgtgaaaagatgacc-3′,下游5′-caggaggagcaatgatcttg-3′,产物片段为660bp。
扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,凝胶成像系统下观看。
重组质粒转染BRL细胞及分泌型IL-10的表达转染前24h调整细胞数,将BRL细胞接种于6孔板中,使转染时细胞铺满孔底的50%~60%,改换2mL含有100mL/L小牛血清的DMEM培育液备用。
按PEIjet-gal转染体系说明书,将重组质粒和空质粒别离转染BRL细胞,每组3孔,24h后弃上清,换2mL含有100mL/L小牛血清的DMEM培育液。
以后每24h搜集上清,并换2mL新鲜培育液。
取转染后一、二、4、八、1二、1六、20、24d的上清,用ratIL-10ELISA试剂盒检测上清中IL-10的含量,并绘制表达曲线。
2结果
大鼠IL-10基因的获取以IL-10外侧引物扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳,未见明显片段。
但以此扩增产物为模板,用IL-10内侧引物进行扩增,并在琼脂糖凝胶上电泳,在紫外透射仪下见大约559bp处显现一DNA片段。
重组质粒的构建与鉴定重组质粒用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,产物进行琼脂糖凝胶电泳,显示有1条与目的基因Mr一致的DNA片段（图1）。
测序结果在BLAST上比对显示,插入片段序列与大鼠IL-10的编码序列完全一致。
图1重组质粒的酶切鉴定（略）
Fig1Restrictionendonucleasedigestionanalysisoftherecombinantplasmid
1:
digestedbyHindⅢ/BamHⅠ;
M1:
100bpDNAmarker;
M2:
λ-HindⅢDNAmarker;
2:
plasmid. PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体转染效率的比较TransfastTM脂质体组IL-10mRNA表达较低,在转染后2d达到顶峰（表达量仍低于β-actin）,而后迅速下降,第8天表达消失。
而PEIjet-gal脂质体组IL-10mRNA表达明显高于β-actin,在转染终止即达顶峰,持续高水平表达至16d后才开始下降,到转染后20d仍有较高表达（图2）。
图2利用不同脂质体转染后BRL细胞中IL-10mRNA的表达（略）
Fig2ExpressionofIL-10mRNAinBRLcellstransfectedbydifferentliposome
A:
TransfectbyliposometransfastTM;
B:
TransfectbyliposomePEIjet-gal;
M:
DNAmarkers;
0,1,2,4-16:
0,1,2,4-16daysposttransfection.
重组质粒转染后分泌型IL-10的表达转染空质粒者几乎测不到IL-10的表达;
转染重组质粒者可检测到高浓度的分泌型IL-10的表达,在转染终止后第2天达到顶峰（μg/L）,第4天即迅速下降,第8天后维持长时刻的低水平表达,其表达曲线见（图3）。
图3分泌型IL-10的表达（略）
Fig3ExpressionofsecretoryIL-10
3讨论
IL-10是肝纤维化的重要拮抗因子。
可是,IL-10在体内R半衰期仅数小时,为了维持血药浓度,需多次注射,且费用昂贵。
另外,静脉注射IL-10作用缺乏靶向性。
若是能将IL-10基因转移到适合的靶细胞内,使其在肝脏较稳固的表达,就可能解决上述问题。
肝纤维化的形成机制十分复杂,有多种细胞参与其中,除起决定性作用的肝星状细胞（HSC）外,还有肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞等［3］。
咱们以为肝细胞作为基因转移的靶细胞较为适合,基于以下几点考虑:
（1）肝脏中,肝细胞在数量上占绝对优势,将其作为靶细胞,能够保证目的基因在肝脏中的高表达;
（2）肝细胞膜表面有一种特异性的去唾液酸糖蛋白受体,为提高基因转移的靶向性提供可能［4,5］;
（3）肝细胞在解剖上与HSC毗邻,在后者的激活与肝纤维化的进程中起着举足轻重的作用;
（4）本实验室以往的研究显示,IL-10对肝纤维化动物模型及在体的HSC作用超级显著,而单纯将IL-10直接作用于体外培育的HSC,却阻碍甚微［6-8］。
这提示IL-10对HSC的作用是一个多细胞、多因子参与的进程,而肝细胞可能在其中扮演重要角色。
基因医治中,载体和转染途径的选择相当重要。
病毒载体普遍存在生物平安性问题;
另外,目前比较经常使用的腺病毒载体尽管转染效率高,但会引发强烈的免疫反映,大大降低再次转染的效率。
脂质体作为载体不存在上述问题,但转染效率低。
肝细胞膜上有高密度的去唾液酸糖蛋白受体,可与半乳糖特异性结合。
目前,许多研究利用这一特性,进行肝靶向药物递送或基因递送,取得了专门好的成效［9,10］。
jetPEITM-Gal转染体系是在阳离子脂质体上结合半乳糖,使对肝细胞的靶向性和转染效率都大大提高。
咱们通过巢式PCR方式扩增了在体内微量表达的IL-10基因,成功构建了重组质粒,并转染体外培育的大鼠肝细胞系BRL,取得了高水平的分泌型IL-10的表达。
同时发觉受体介导的脂质体可大大提高对肝细胞的转染效率,延长IL-10基因的表达时刻。
为尔后的动物体内实验奠定了基础。
另外,还发觉转染后第4天开始显现IL-10mRNA与蛋白表达的分离现象,提示在后期存在翻译水平的抑制。
这种抑制是不是由于后期体外培育的细胞密度太高所致,尚不得而知。
动物体内实验是不是也会显现这种分离现象,有待进一步研究。
【参考文献】
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