HSCT6细胞培养及鉴定实验报告文档格式.docx

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（4）合成基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）及其组织抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP）:

正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。

（5）表达细胞因子及受体：

正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。

此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Plateletderivedgrowthfactor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。

（6）参与肝窦血流调节：

HSC伸出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。

一、材料与方法

1.实验材料

1.1实验材料

大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自与中国科学院上海细胞所。

1.2主要仪器

CO2细胞培养箱：

上海力康仪器有限公司SmartCellHF-90

生物安全柜：

上海力康仪器有限公司HF1200LC

台式高速冷冻离心机：

上海力康仪器有限公司Neofuge15R

台式低速离心机：

上海飞鸽仪器有限公司TGL-16GB

荧光倒置显微镜：

日本尼康公司EclipseTS100-F

显微镜：

日本尼康公司E200

病理图文分析系统（工作站）：

上海千屏公司

恒温水浴锅：

上海精宏仪器厂DK-80

液氮罐：

成都金凤仪器厂YDS-50-125

-20℃低温冰箱：

合肥美菱公司DW-HL388

单子分析天平（0.01mg）：

德国梅特勒AB304-S

手动单道移液器：

德国Eppendorf公司Researchplus

1.3主要试剂

名称

货号/批号

厂家

PBS磷酸盐缓冲液粉剂

PBS0060,Lot#

福州迈新生物技术开发有限公司

胎牛血清

美国Lifetechnologies公司

DMEM培养基

0.25%胰酶

青霉素-链霉素双抗（10000U）

SC30010，Lot#J130071

美国Hyclone公司

小鼠抗a-SMA单克隆抗体

美国SantaCruz公司

小鼠两步法免疫组化试剂盒

KIT9902，Lot#1301319902

浓缩型DAB试剂盒

DAB0031，Lot#1

FITC标记山羊抗小鼠二抗

北京中衫金桥有限公司

油红O染色试剂盒

D027

南京建成生物工程有限公司

苏木素染液

油酸

西安化学试剂厂

中性树胶

中国上海标本模型厂

2.实验方法

2.1试剂配制及抗体稀释

10%血清完全培养基：

10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。

0.2mM的油酸完全培养基：

1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培养基中。

a-SMA抗体工作液：

a-SMA一抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。

FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液：

FITC标记的山羊抗小鼠二抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。

20%DMSO细胞冻存液：

2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培养基中。

油红O染液：

油红O储存液与双蒸水以3:

2的比例混合，并用滤纸进行过滤，使用前2h内配制。

2.2HSC-T6细胞培养基本操作方法

细胞传代：

观察培养瓶（25cm2）中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代，操作步骤如下。

开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶（25cm2）、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800r/min离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养，6h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%～70%贴壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5ml的含0.2mM油酸的完全培养基，继续培养。

细胞冻存：

消化、离心、重悬步骤同细胞传代，取1ml的细胞重悬液，加入1ml的20%DMSO的细胞冻存液颠倒混匀，并移至2ml的冻存管中，冻存管中细胞经4℃（20min）、-20℃（20min）的程序降温后，转移至液氮中冻存。

细胞复苏：

从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37℃水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻，倒置显微镜下观察细胞密度并接种到培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。

2.3HSC-T6细胞a-SMA免疫组化染色

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA免疫组化实验，步骤如下：

2.3.1细胞固定：

培养皿中加入1ml1:

1的冷的丙酮和甲醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。

培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。

用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50μL37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。

2.3.4一抗孵育

培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL，4℃孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。

2.3.5二抗孵育

培养皿中滴加Elivision试剂盒中的增强剂1滴（大约50μL），并于室温孵育20min，PBS漂洗3次，每次3min，然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴（大约50μL），37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次3min。

2.3.6DAB显色

培养皿中滴加新鲜配制的DAB溶液50μL，室温孵育10min，显微镜下观察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时，立刻将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。

2.3.7苏木素复染

苏木素复染3min，自来水冲洗使培养皿中的细胞核返蓝。

2.3.8封片

培养皿中滴加甘油，并以盖玻片封片。

2.3.9观察拍片

在正置光学显微镜下观察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激动蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。

2.4HSC-T6细胞a-SMA细胞免疫荧光

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA细胞免疫荧光实验，步骤如下：

2.4.1细胞固定：

1的冷的丙酮和异丙醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。

2.4.2细胞通透化：

2.4.3封闭

2.4.4一抗孵育

2.4.5二抗孵育

培养皿中滴加50μL稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min。

2.4.6观察拍片

设置荧光倒置显微镜激发波长为488nm，观察细胞alpha-平滑肌肌动蛋白荧光显色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。

2.5HSC-T6细胞油红O染色

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，并以含0.2mM油酸的完全培养基进行干预，使细胞富集脂肪滴，细胞待细胞达到50%贴壁融合时，进行油红O染色实验，步骤如下：

2.5.1细胞固定：

培养皿中加入4%多聚甲醛溶液，室温固定30min，弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。

2.5.2油红O染色：

培养皿中加入1ml新鲜配制的油红O染液，室温放置10min后弃去染液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。

2.5.3苏木素复染

培养皿中加入1ml苏木素染液室温染色30s，弃去苏木素染液，以双蒸水漂洗3遍，每次5min，加入1ml的自来水反蓝。

2.5.4封片

培养皿中滴加一滴甘油并以盖玻片封片。

2.5.5观察拍片

正置光学显微镜下观察肝星状细胞胞浆中红色脂肪滴染色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。

2.6HSC-T6细胞VitaminA脂滴荧光观察

设置荧光倒置显微镜激发波长为328nm，观察培养的HSC-T6细胞胞浆中VitaminA脂滴荧光。

二、结果与分析

1.HSC-T6细胞培养传代的形态学特征基本情况

HSC-T6细胞株培养5-8代时能观察到细胞较大，呈多边形、多核，且胞浆富含脂滴及VitaminA形态（见图1），8代以后继续培养HSC-T6细胞表现为肌成纤维样细胞的形态学特征，即HSC-T6贴壁后即开始伸展，胞体增大呈不规则的多边形，并伸出许多伪足与其他HSC-T6细胞相连形成片状（见图2）。

HSC-T6细胞大量增殖，细胞密度变大后，细胞形态变小，略呈梭形的多边形，且有伪足与相邻细胞相连，在培养表面均匀的分布（见图3）。

A

B

C

D

图15-8代HSC-T6细胞形态特征

A、B：

荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×

；

B、C：

荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×

（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）

图28代后HSC-T6细胞形态特征

图3HSC-T6细胞密度加大时形态特征

2.HSC-T6细胞鉴定

2.1HSC-T6细胞脂肪滴油红O染色

含0.2mM的油酸的完全培养基使HSC-T6细胞富集脂滴，并用油红O染液染色，光学正置显微镜下观察胞核呈蓝色，胞浆中有点状红色，为脂滴着色（见图4）。

图4HSC-T6细胞脂滴的油红O染色400×

2.2HSC-T6细胞VitaminA脂滴紫外激发的自发荧光

HSC-T6细胞中的脂滴在328nm紫外波长的激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光（见图5）。

图5HSC-T6细胞VitaminA脂滴328nm紫外激发荧光200×

暗场VitaminA脂滴荧光；

C、D叠加场VitaminA脂滴荧光

2.3HSC-T6细胞a-SMA免疫组化

HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，细胞爬片显示HSC-T6细胞胞浆均可见棕黄色颗粒状沉淀，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色为阳性。

图6HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色（A：

100×

B、C、D：

400×

）

2.4HSC-T6细胞a-SMA免疫荧光

HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，a-SMA免疫荧光显示HSC-T6细胞胞浆均可见FITC的激发的绿色荧光，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫荧光为阳性。

A1

A2

B1

B2

C1

C2

D1

D2

图6HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色

（A1、B1、C1：

荧光倒置显微镜下明场观察200×

A2、B2、C2：

荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察200×

D1荧光倒置显微镜下明场观察400×

C2：

荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察400×