脂肪酶在连续流化床反应器中催化交换棕榈硬酯与豆油.docx
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脂肪酶在连续流化床反应器中催化交换棕榈硬酯与豆油
脂肪酶在连续流化床反应器中催化交换棕榈硬酯与豆油
此项研究的目的是在连续流床化反应器里使用南极假丝酵母中的商业固定脂肪酶，催化交换棕榈硬酯与豆油。
该交换间接减少了固体脂肪在35oC（SFC35oC）的含量。
最佳的反应条件是建立在之前一批响应面方法论作为一个温度的函数和介质的组成。
该反应器的操作需连续21天。
在前16天里，经初始性观察没有显著的减少，在SFC35oC减少了30%-40%。
随后，发现活性进一步地降低，21天后SFC35oC仅有5%。
该生物催化剂可部分恢复并能在同样的条件下重复使用，再延长21天。
一个类似的失活例子被观察，它描述了一系列灭活动力学模型。
先贤和重新启动的生物催化剂（分别为17天和0.035d-2）的估计值为半衰期和失活系数均相同。
游离脂肪酸含量在连续化反应器中明显低于间歇式（2%-6%）
关键词：
连续流化床反应器；交换；脂肪酶；人造黄油油脂；运行稳定；响应面方法论。
1.引言
功能性，营养和感官性能的天然油脂取决于其脂肪酸组成和它们组成脂肪酸在甘油三酯（TG）中的分布。
通过甘油三酯（也称酯）间的交换，它是有可能改变结晶和熔融性能的油脂，不修改脂肪酸的组成。
这些变化由酰基重排产生对制造人造黄油很重要。
在食品工业中，脂肪混合物的交换反应在当前实现了高位（高达270oC），低压，至少2小时，使用烷基化金属或碱金属作催化剂。
酰基的交换移动是随机的。
也就是，最后的产物可能仍然包含残留的催化剂和相当大量的其他结构的产物，随之而来可能发生的是产量下降[1]。
交换的程度经常用于间接评价测量混合物中固体脂肪交换前后的含量（SFC）。
SFC的测量遵循一个关于测量的标准协议，通过核磁共振（NMR）限定在该范围内的脂肪结晶：
SFC在35oC（SFC35oC）对人造黄油表面特别重要，因为它关系到其进入口中的熔点限值。
这个SFC35oC的酯交换值应低于起初相对应的值，并且应尽可能的低，从而防止人造黄油表面质感沙质和粗糙。
SFC值在10，20和30oC（SFC10oC，SFC20oC和SFC30oC）也是重要的，因为它们关系到流变行为的油脂分别在冬季和夏季的储存和包装。
在国内使用，SFC10oC将决定在冰箱储存条件下最佳产品的硬度。
SFC10oC和SFC20oC是重要的参数已确定在生产人造黄油面包是否使用一种配方。
近年来，为了交换脂肪混合物，用脂肪酶（acylglycerolacylhydroases，EC3.1.1.3）取代无机催化剂已经被尝试，有与这种酶法的路此线关系到的化学过程带来的利益[2]。
高费用的商业非固定和固定脂肪酶，加上低运行的稳定性，后者已经被却认为主要制约因素，将其用于食品工业，尤其用于生产商品油，如为人造黄油和浓缩油的油脂。
此外，该交换反应的机制涉及水解酯键后再酯化工艺。
这可能导致在反应中高水平的游离脂肪酸（FFA）积累，主要存在的是水[3-9]，由于游离脂肪酸被氧化导致交换产物产量降低并且形成不好的风味（酸败）。
另一方面，低水平的产品部分脂肪酶表示重要稳定性能为油/水乳剂[10]有利于人造黄油的生产[11]。
脂肪酶催化脂肪混合物已经在存在有机溶剂[12-15]或在无溶剂介质中实现。
[4，7，9，11，16-23]。
有机溶剂溶解高熔点油脂，如棕榈硬脂（POS，滑熔点高于44oC），使反应在室温下进行。
然而，在这些系统中，分离和回收改造的甘油三酯必须被做到。
几项研究已经被调查，脂肪酶催化剂在连续流化床反应器中使用的可能性，减少酶解过程的消耗并使当前的化学过程完全[2-4，8，24，25]。
运行的稳定性固定脂肪酶的表现取决于几个参数，如生物催化剂本身，脂肪的水分含量和存在的氧化产物与精炼这些脂肪的程度有关。
本研究的目的是为了贯彻落实在连续模式下满载无溶剂介质中，使用商业的南极假丝酵母脂肪酶（诺维信435；诺维信，丹麦）实现POS与豆油之间的交换。
在之前的连续实验中，优化培养基配方和反应温度，当使用生物催化剂是初始水分活度（aw）是0.40，进行了间歇式。
连续交换按实验室标准被实施，在一种连续流化床反应器（CFBR）中进行。
实事上，初步的实验表明填充床反应器不适合这个反应系统，因为高压造成损失。
这种脂肪酶的动力学活性衰减被调查，准备使酶活性恢复到初始活性被尝试。
这部分文章的内容被保护，是葡萄牙人的专利。
2.材料与方法
2.1材料
提炼，漂白和防臭POS和大豆油，这些是由FIMA/VG提供，消耗产品，葡萄牙。
商业制备的从南极假丝酵母中提取的脂肪酶（诺维信435），固定相吸附于大孔可渗透的丙烯酸树脂（珠状颗粒，直径0.3-0.9毫米；块密度约为430kg/m3），它是由诺维信公司捐赠，A/S，Bagsvaerd，丹麦。
这种脂肪酶的制备是耐热的且最大活度约在70-80oC。
然而，制造商建议让其工作温度在40-60oC，以实现更高的运行稳定性。
2.2方法
2.2.1一批交换反应
在一批反应器中实施的初步研究混合脂肪的最初成分和反应温度。
这种脂肪酶加入到含有不同比例的POS和豆油的上述反应介质中，出于实验设计，下面加以说明。
反应在有磁力搅拌，恒温的圆柱形玻璃反应器（100mL）中进行，温度高于55oC防止介质凝固。
经过120分钟的反应时间，取5毫升样品，滤纸过滤，用大约80oC的烤炉除去生物催化剂的颗粒，实验的SPF值在35oC（SFC35oC），游离脂肪酸和氧化产物。
反应持续的时间被固定为2小时，因为更长的反应时间不会使这种酶的反应路线比当前的无机催化剂交换有竞争力。
除非另有说明，否则这种生物催化剂水分的初始活度（aw=0.40）,它的负荷固定在5wt-%。
最佳的反应条件建立在响应曲面方法[27，28]。
实验根据中央复合旋转设计（CCRD）作为POS浓度（50-80%）和反应温度（60-80%）的一个功能。
进行全部的12个实验：
4个阶乘点，编码为（+1）和（-1）；4个星形点，编码为（+α）和（-α）以及4个中心点，编码为0（表格1）。
调查SFC35oC最大值的减少可以实现，另外的一批实验被进行，条件是70oC，反应28小时。
反应介质由55%POS和45%豆油组成，使用诺维信435。
表格1.中心复合旋转设计以反应温度和POS的使用浓度（编码和解码值）作函数，脂肪混合物在酶反应前后各自的SFC35oC值，FFA值，Abs232nm和Abs270nm值。
实验
实验设计
结果
编码值
解码值
SFC35oC
FFA
Abs232nm
Abs270nm
POS
温度
POS[wt-%]
温度[oC]
初始
最终
初始
最终
初始
最终
初始
最终
1
-1
-1
54.4
62.9
16.76
8.03
0.34
2.59
0.139
0.138
0.672
0.686
2
-1
1
54.4
77.1
16.72
5.44
0.24
3.44
0.082
0.132
0.640
0.722
3
1
-1
75.6
62.9
25.02
16.01
0.35
2.65
0.103
0.084
0.652
0.651
4
1
1
75.6
77.1
24.84
14.04
0.56
3.15
0.079
0.110
0.610
0.741
5
-α
0
50.0
70.0
14.57
5.03
0.25
2.72
0.094
0.131
0.649
0.695
6
+α
0
80.0
70.0
26.21
19.13
0.23
3.06
0.123
0.140
0.601
0.643
7
0
-α
65.0
60.0
21.01
10.70
0.27
3.08
0.120
0.103
0.647
0.675
8
0
+α
65.0
80.0
19.58
8.19
0.23
2.95
0.161
0.153
0.670
0.782
9
0
0
65.0
70.0
20.66
10.49
0.24
3.00
0.097
0.134
.0675
0.676
10
0
0
65.0
70.0
20.566
10.77
0.26
4.43
0.110
0.098
0.649
0.686
11
0
0
65.0
70.0
21.03
10.77
0.25
2.85
0.114
0.136
0.637
0.680
12
0
0
65.0
70.0
20.84
10.48
0.36
2.79
0.085
0.136
0.618
0.676
2.2.2连续交换实验
为了交换测试连续流化床反应器，条件在70oC，混合物中含有55%POS和45%豆油起初始SFC35oC值（c.f.2.2.5.）是17.8。
此连续流化反应器是玻璃圆柱形外壳（内部直径=2厘米；总高=20厘米）。
反应器里的温度是通过外壳内的循环水使温度维持在70oC。
脂肪混合物在70oC，从一个储蓄池中不断泵出，通过硅油管，最终送到生物反应器的底部。
为了避免管内的脂肪凝固，必须在其表面盘绕包含恒温电阻的绝缘皮带，7.6个生物催化剂被使用相当于15.7立方厘米。
21天后，固定脂肪酶在连续流化床反应器被回收并且在相同条件下其被重复使用期限再延长21天。
2.2.3进处理的生物催化剂被用在连续流化床反应器
经过第一次在连续流化床反应器中的反应，酶被生物反应器排出，用正己烷（3×50mL）洗涤反应器并进行真空干燥40oC，15分钟。
生物催化剂的水分活度（aw），在25oC下用RHDT公司的湿度传感器（DMS-100H）进行实验测其反应前后的使用率。
处理后，脂肪酶活性在复交换实验中即55wt-%。
样品在19分钟和60分钟后被取出测定SFC35oC。
用20%新鲜的诺维信435做平行实验。
2.2.4脂肪酶失活动力学
为了描述失活动力学，每个实验数据在时间t换算成分数的原活性，即它的残余活性。
这个残余活性，被认为在t时间SFC35oC减少量与初始时SFC35oC减少量的比值。
2.2.5分析方法
2.2.5.1SFC测定
次交换反应间接地评价了脂肪结晶在35oC（SFC35oC）的减少程度，在一个脉冲核磁共振光谱仪（MinispecP-20i；IBM）中测定SFC35oC。
经核磁共振分析。
样品在60oC被氧化，在此温度下保持10分钟，然后在0oC下保持60分钟，最后在测试温度（35oC）维持30分钟，测量之前的SFC35oC[29]。
2.2.5.2游离脂肪酸含量测定
游离脂肪酸的测定是通过0.1N氢氧化钠水溶液的滴定，它的百分含量（wt-%）是在油酸分子量的基础上计算出的。
2.2.5.3氧化产物
热氧化油脂过程的时间可间接通过紫外吸收在232nm，Abs232nm处（与氧化产物的初始活动有关，即共轭氢化过氧化物）和在270nm，Abs270nm（最终的氧化产物，即游离脂肪酸，醛和酮）被评价，在异辛烷中含有1%。
（wt/vol）的脂肪混合物。
2.2.5.4统计分析
使用统计软件（版本5；Statsoft,美国）分析中央复合旋转设计的结果。
直线和二次方程的各因素进行研究，以及它们的直线交换，计算水解和氧化动力学。
通过方差分析评价它们的重要性。
实验错误的方差，被假定固定不变的实验范围，由4个重复的中心点评估[27]。
在中央复合旋转设计中，利用5个水平为每个因素拟合实验数据点的
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