973项目申报书植物免疫机制与作物抗病分子设计的重大基础理论管理资料Word文档下载推荐.docx
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目前植物免疫的表观遗传机制研究刚刚起步，若干重要问题亟待解决。
本项目将利用相关课题组已经建立的国际前沿植物RNA沉默及抗病毒分子机理的研究水平的基础上，鉴定新的表观遗传因子与作用机制，系统研究植物中RNA沉默介导的表观遗传机制在植物免疫中的新的调控功能；
建立重要作物病害如黄单胞菌（白叶枯病）对水稻siRNA的调控的全基因组网络，阐明植物miRNAs是否通过调控R基因直接参与植物抗病反应，在新的层面上认识植物免疫的RNA沉默途径的应答机制，建立创新的植物免疫研究理论与技术体系，在农作物抗病的理论和转基因抗病新技术上取得新的突破。
4.剖析作物抗病性与产量性状关联的分子机制，建立学科交叉领域
以水稻抗病反应与发育的交互作用为模式系统，阐明水稻SAR基因OsNPR1如何调控生长素发育途径，从而调节水稻产量性状的分子机制；
阐明ET发育途径参与水稻稻瘟病抗性的分子机理；
阐明以水稻病毒病（RDV和水RBSDV）侵染植物导致植物矮化的分子机理，为病毒防治寻找新的途径；
建立新的作物抗病与发育交叉研究领域，在学科创新上有持续的生命力。
5.系统发掘作物重要抗病新基因，解析新的抗性机制
目前从水稻和小麦中克隆的抗病基因数量非常有限，极大部分抗病基因还未知。
这对于全面理解作物与病原菌的相互作用及抗病机制是主要的限制因素。
尤其是对广谱持久抗病性的分子机制基本上是空白。
此外，对于类似纹枯病这样的水稻病害，其危害已越来越严重，但在水稻中迄今尚未鉴定有重要抗性的基因位点。
本项目将系统克隆30-50个水稻抗病基因（尤其是广谱持久抗病基因）、、麦类慢锈病抗病主效QTL等、以及重要的抗病调控基因，系统剖析这些新抗病基因的抗性机制，尤其将在克隆水稻广谱抗病基因ROD1、Pigm、小麦慢条锈苗期主效数量抗性基因Yrq1及大麦慢叶锈成株期主效数量抗性基因Rphq4的基础上，确定其在免疫反应网络中所承担的功能，提出植物广谱持久抗病性遗传与分子机理的模型，也为接续的分子设计育种奠定基础。
6.创立并实践作物抗病分子设计的基础理论与技术体系
本项目将整合上述基础理论和基因资源，解决抗病分子设计育种的关键科学问题，包括：
优异等位或同源抗病基因的开发、基因簇内复等位基因的重组和功能评价；
新型抗病基因的分子设计和功能评价；
抗病基因的聚合转化/转育及其功能评价。
本项目将率先建立水稻和小麦抗病分子设计的实践模型，发展2-3种农作物抗病改良的新策略，为广泛开展作物抗病分子设计育种奠定理论与技术基础。
通过科学的分子手段，结合传统育种手段对农作物栽培品种进行遗传改良，得到抗病性显著改良和广谱抗病的水稻、小麦等农作物的品系7-10个，获得2-3个能够抗水稻纹枯病、病毒病等疑难病害的农作物品（株）系。
7.创造系列高水平的研究成果，大幅提升我国在本领域的国际地位
在国内外核心刊物上发表研究论文100篇左右。
其中，在国际一流学术期刊（IF>
）上发表论文10－15篇，申请发明专利20－30项，授权专利7－10个，主办一次大型专业国际学术会议，大幅提升我国科研团队在国际上的研究地位。
8.全面推进优秀人才培养和创新团队建设
依托项目实施，进一步凝练我国在植物免疫和作物抗病分子领域的战略目标，培养一批具有科学创新精神和在专业领域具有较高国际显示度的中青年学科带头人，建设具有国际一流水平的研究队伍。
培养博士后和研究生150名左右，为我国现代农业生物技术的发展奠定人才基础。
三、研究方案
（一）总体学术思路
本项目紧密结合农业生物学学科前沿，并为保障我国粮食生产安全和支撑国家转基因新品种培育等重大战略需求，建立以我国主要农作物重大病害抗病机制为模式的创新研究体系。
在研究思路上强调顶层设计与整合，以“一线四点六面”的格局组织项目的实施，即：
1条主线，4个关键科学问题，6方面研究内容。
在具体研究体系上，针对重要的作物-病害体系包括水稻和麦类病害的新抗病基因和调控基因的克隆与功能机制，并整合与创新模式植物拟南芥的前沿免疫研究体系。
在技术路线上广泛采用正向、反向遗传学和表观遗传学，并结合生物信息学、蛋白-蛋白相互作用、蛋白组学、现代生物化学与细胞生物学等研究技术。
在目标集成上，剖析作物对重要病原菌的识别机制与应答的信号网络，研究作物广谱与持久抗性尤其是数量性状（QTL）抗性的分子机制，分析与整合作物抗病性与产量性状的互作途径，并紧密结合作物遗传育种，建立作物抗病分子设计的理论、应用基础和共性技术体系。
（二）总体技术途径
目前‘组学’和‘复杂性状’的研究方法已贯穿到生物学研究的各个方面，根据总体研究目标和目前学科的发展趋势，本项目将针对农作物与病原微生物相互作用过程中的关键环节，充分利用遗传学和表观遗传、植物病理学、分子生物学、蛋白质相互作用、细胞生物学、生物化学等现代生物学研究手段，将植物-病原菌的功能基因组学、蛋白组学、转录组学和生物信息学等精密结合，以严密的设计和精准的实验分析，解析和阐明植物免疫的细胞、生化与分子过程。
因此，本项目将发展和利用以下相互交织的技术平台：
1.充分运用遗传学与基因组学平台，鉴定重要的抗病或免疫调控因子。
利用作物抗病资源和大规模突变体筛选，定位克隆重要的抗病基因（包括QTL）和关键调控基因，分析抗病等位基因的结构与功能差异，并利用植物转化和基因敲除（knockout/knockdown）等验证基因功能；
利用蛋白质互作和蛋白组学等技术，鉴定重要的互作蛋白或靶蛋白等；
利用表达组学结合基因功能分析，分离鉴定重要的免疫调节基因。
2.建立表观遗传分析技术体系和遗传资源，分析表观遗传机制对植物免疫的调控，鉴定有调控功能的sRNA及其靶标基因。
3.利用生物信息分析平台，对大规模植物和病原菌基因组数据库进行序列分析和基因挖掘鉴定重要的免疫/抗病调控因子、响应因子和路径节点等，分析重要病原的致病性基因簇结构及其寄主靶标，预测抗病蛋白的结构和互作模式，并根据重要的免疫信号转导途径建立基因调控网络。
4.利用激光微切割技术结合基因芯片和生物信息学分析平台，精确分离鉴定细胞特异和侵染早期的寄主响应基因，尤其是对腐生菌（小麦赤霉病）的抗病相关基因，建立防卫反应网络。
5.建立和利用细胞生物学和生物化学平台，包括各种显微观察方法、标记与跟踪技术、免疫共沉淀、体内外生化活性分析等技术，验证重要的植物免疫细胞学过程，分离重要的活性小分子，抗病的激素途径及其与产量性状等的关联。
6.将分子遗传、转基因技术和作物育种学结合，进行抗病分子设计育种，选育广谱抗病水稻和小麦品系，建立分子设计育种的理论与技术体系。
遗传学途径表观遗传途径生化途径生物信息途径
作物抗病分子设计的理论与技术体系
作物抗病资源,拟南芥突变体
基因定位克隆与功能分析
植物抗病机制与信号途径
抗病育种分子标记与分子设计
抗病等位基因和功能分化
抗病TGS途径,sRNA表达谱
miRNA,RdDM调控R基因
RNA沉默与水稻抗病性
水稻sRNA靶标与抗性途径
植物新抗病理论与技术体系
蛋白互作,关键基因鉴定
致病因子新靶标与功能
免疫调控关键节点
激素途径和产量性状
抗病高产育种基础理论
重要数据库分析与发掘
腐生菌侵染与表达谱分析
重要调控基因鉴定与分析
蛋白互作的分子特征与预测
重要免疫途径基因调控网络
主要农作物重大病害抗病机制为模式的植物免疫创新研究体系
（注：
本设计为技术流程的主要途径，相互之间有交织）
（三）创新性与特色
植物免疫与作物抗病性研究是国际植物生物学研究的前沿热点领域，研究的问题复杂、涉及的学科范围和技术方法广、学科发展快、国际竞争大。
目前我国在这方面的研究与技术体系与欧美等国家相比，还具有很大的的差距。
但是，我国在作物应用基础研究以及相关领域人才队伍建设方面具有明显优势。
本项目根据学科发展和本国农作物病害的特点，立足于创新、突出研究重点、发挥自身优势，做出跨越式的发展并提升我国在本领域的研究水平和地位。
本项目在以下方面具有创新性和特色：
1.新的总体研究思路。
围绕国际学科发展趋势，以系统阐明植物包括重要粮食作物的免疫机理为目标，结合我国转基因新品种培育中抗病分子育种这一重大需求。
以作物对重要活体寄生（biotroph）与腐生（necrotroph）病害的免疫应答及其互作为主线，强调顶层设计与整合；
建立以我国主粮作物重大病害抗病机制为模式的创新研究体系。
2.从农业生产和学科发展中提炼关键科学问题，创建特色研究体系。
本项目紧密结合学科创新和国家重大需求，以我国重要农作物病害抗性为研究重点，借鉴以拟南芥为主要模式的研究方法与研究成果，提出了4个关键科学问题，重点研究作物广谱持久抗性的分子基础；
植物抗病性的表观遗传学机制；
抗病性与产量性状的关系，及抗病育种分子设计新思路。
为此，在相关领域设置了6个相互交叉的研究课题，并把主要研究方向集中在水稻和麦类抗病分子机理，推动以水稻抗病性为主要模式体系的转换，建立我国特色的植物免疫和作物抗病育种基础理论的前沿领域。
3.新的前瞻性研究部署。
国际上植物免疫的研究已经进入更高层次的研究领域。
本项目密切结合学科发展动向，前瞻性地部署前沿研究领域，重点包括植物基础免疫与专化性免疫的交互作用（cross-talk）、表观遗传机制对于植物免疫的调控功能和新的抗病性研究策略、作物广谱持久抗病性的机制等。
尤其是植物免疫的表观遗传机制是植物生物学的新兴研究领域，存在若干重要的科学问题亟待阐明。
国际上，包括RdDM途径的表观遗传学研究主要集中在植物自身的开花发育调控和非生物胁迫应答。
抗病RNA沉默的研究也主要集中在拟南芥和烟草上。
表观遗传机制应答生物胁迫和作物的抗病沉默机制的研究的报导寥寥无几。
以植物免疫的表观遗传机制为主线，从模式植物到我国主要粮食作物，结合项目各课题组已建立起来、各具特色的实验体系和工作平台，拓展表观遗传机制调控抗病（病毒、细菌和真菌）应答研究领域。
本项目对植物免疫的表观遗传机制的创新研究，将为农作物抗病从理论和应用实践上开辟新的研究体系。
4.利用和创制特色研究材料。
为实现项目目标，本项目将广泛收集和创制新型的研究材料，如作物广谱抗病和QTL遗传资源、抗腐生病害遗传资源、抗病基因抑制（suppressor）突变体。
并以已经定位克隆的、有自主知识产权的一批重要广谱抗病基因如xa13、Xa30，Pigm、Pid-2、ROD1、OsNPR1、等为研究的重要出发点，紧密结合作物遗传育种，建立作物抗病分子设计的理论、应用基础和共性技术体系。
5.新的技术路线集成。
本项目广泛采用‘组学’和‘复杂性状’的研究方法，利用正向、反向遗传学和表观遗传学，并结合生物信息学、蛋白组学、现代生物化学等研究技术，系统剖析作物对重要病原菌的识别机制与应答的信号网络，并整合作物抗病性与产量性状的互作途径，创建抗病分子设计育种体系。
尤其将开展水稻抗瘟性复等位基因的簇内重组，创造新的广谱抗病基因位点，在抗病遗传理论与育种实践上都是一个有重大创新意义的课题。
6.新的目标视野。
本项目除了要在植物免疫学科领域上创立我国的高水平前沿研究优势，取得系统性的研究成果，同时也要在作物广谱持久抗性尤其是数量性状（QTL）抗性的分子机制、腐生菌（如纹枯病）的抗病基因资源、作物抗病育种的分子设计理论与实践等方面建立国际领先的研究体系与技术平台。
创新性研究成果（如水稻广谱抗病性基因）的应用有可能为农作物抵抗类似于水稻纹枯病这样的疑难病害做出重大贡献。
从而为推动抗病新策略、新技术的发展提供直接的指导。
7.新的研究队伍建设。
依托本项目的实施，将进一步凝练我国在植物免疫和作物抗病分子领域的战略目标，培养一批在专业领域具有高国际显示度的中青年学科带头人，建设具有国际一流水平的创新研究团队。
（四）取得重大突破的可行性分析
在植物免疫和作物抗病性研究领域，虽然要全面超越国际一流研究水平还要进行长期、艰苦的研究与探索，但是本项目的实施也存在诸多有利因素，其中包括研究资源、研究基础、人才队伍和仪器装备等几方面的有利条件，本项目具备圆满完成预定计划的能力和工作条件。
1.项目有广泛共识：
本项目已经经过3年多的筹备，尤其通过2009年5月第349次香山科学会议《植物先天免疫机制》、2010年2月第9次中国科学院上海交叉学科论坛《植物免疫与作物生产》，与会专家与项目组骨干进行了广泛的讨论，根据学科的发展与国家农业的重大需求，凝练了关键的科学问题与重点研究方向，研究思路明确，目标集成可行性强。
2.具有丰富的研究资源。
我国主要农作物栽培历史长，栽培区域差异大，抗病性资源丰富，并具有较高的抗病育种水平。
这为本项目通过功能基因学的方法，研究不同农作物品种抗病分子机理，在以水稻为主的重要农作物的抗病分子机理研究，可以做出创新性和有特色的研究成果。
3.技术路线成熟。
近年来植物分子生物学研究飞速发展，拟南芥及水稻基因组已相继完成测序，小麦基因组454高通量序列的丰富，基因定位克隆已经实现日常化。
其它相关的平台,如表观遗传、蛋白组学、表达组学、生物信息学、植物病理学、生物化学、蛋白质相互作用、细胞生物学等现代生物学研究手段均已建立并不断改进。
这些成熟的技术平台为顺利开展本项目并完成目标提供了可靠的保障。
4.研究基础较好。
通过承担国家863计划、国家基金重大研究计划和重点项目、国家转基因新品种培育重大项目等多项研究的积累，本项目组各个课题已经在科学研究思路、实验材料、研究实验体系、数据分析能力、国际学术交流等方面打下了较好的研究基础。
一些前期研究已经处于稳步开展阶段，多个作物主要抗病基因和拟南芥免疫关键调控基因已经克隆，植物表观遗传机制已有重大新发现，为本项目的顺利实施提供了有力保障。
项目的实施将依托7个国家和3个部门重点实验室（详见工作条件部分），具有先进的仪器设备和国内一流的工作条件。
在植物免疫途径（PTI，ETI）及其互作、植物免疫的表观遗传调控、SAR调控、作物广谱抗病基因的功能机制及其育种应用、水稻抗纹枯病等方面可望有重大的突破性成果。
5.研究队伍具备国际竞争力。
本项目组织的骨干队伍集中了国内优势的研究单位，研究方向全面、合理，分别涉及到农作物抗病、真菌病害、细菌病害、病毒病害等本领域重点分支，在多个研究领域如水稻功能基因组学、植物免疫、作物抗病性、病原菌基因组学、表观遗传等方面做出了一系列突破性的研究成果，。
在过去数年间，本项目骨干作为第一或通讯作者的多篇研究论文发表于国际重要学术期刊如Cell及其系列,Nature系列,Science,PlantCell,PNAS,GenomeResearch,EMBOJ,CellHost&
Microbes,PLoSPathogens，JournalofVirology,PlantJournal,PlantPhysiology,MolecularMicrobe-PlantInteraction等。
具备进行创新研究的团队基础和较强的国际竞争实力。
此外，项目组大部分骨干都曾在国际上著名的实验室中从事植物分子生物学和植物病理学工作多年，在国内建立了优秀的实验室，并和国际权威人士建立了良好的交流与合作关系。
这些条件均对本项目的开展是一个有力的支持。
四、年度计划
研究内容
预期目标
第
一
年
1.拟南芥PTI相关突变体的筛选；
PRR受体蛋白酵母双杂交库的构建；
抗病蛋白系列置换突变体构建与功能分析；
水稻抗病蛋白与病原菌效应蛋白基因的克隆。
2.Xoo鞭毛蛋白基因/解毒蛋白基因及突变体的克隆；
构建Xoo/Xoc鞭毛蛋白等PAMPs编码基因的缺失突变体；
构建多个水稻基因变量表达的双元载体；
效应蛋白基因转基因；
建立纯化EPS天然寡聚体的技术平台以及EPS寡聚体生物活性检测系统。
3.对bir1,snc1,snc2,snc4，mkk1mkk2这5个组成型抗病的突变体做抑制子筛选；
对抑制子进行表型分析及初定位；
建立SAR筛选体系，分析SARD1及SARD2的生化功能；
拟南芥MEKK1结合蛋白酵母双杂交筛选。
4.利用γ-ray辐射诱变和EMS化学诱变抗病品种GM4（Pigm），筛选Pigm基因的抑制因子spi（suppressorsofPigm）；
利用体内和体外方法筛选水稻EMS诱变F2群体，获得对XooLPS敏感性发生改变的突变材料，创建该突变材料的分离群体并开始进行图位克隆；
。
建立分离LPS结合蛋白的生物化学标记体系。
5.采用激光显微切割，结合禾谷镰孢活体荧光标记、基因组芯片等，揭示宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染中、晚期的动态转录组；
研究宿主作物-禾谷镰孢互作细胞学过程；
病毒侵染拟南芥，microarray高通量表观遗传途径相关蛋白基因表达检测；
抗病TGS蛋白目标基因筛选、及其表达谱检测。
6.建立病毒侵染水稻的研究体系，构建针对水稻RNA干扰途径主要基因的转基因RNAi突变体株系，包括RDR1,RDR6,AGOs,PolIV,PolV,DCL2等；
利用酵母双杂交方法，筛选受RDV病毒侵染前后水稻基因表达谱的变化并对其进行生物信息学预测。
7.Xoo诱导水稻小RNA的Solexa测序建立miRNA与siRNA表达谱。
RNA-seq测序，建立mRNA表达谱。
8.获得乙烯耐受水稻株系，对多种致病稻瘟病菌进行感病分析；
利用MCP处理，分析抗性水稻在丧失乙烯反应后对相应的稻瘟病菌发生的抗性变化；
将乙烯耐受基因导入抗性的水稻品种；
将造成组成性乙烯反应将有转入感病水稻品种以及抗病水稻品种中，获得相关的组成性乙烯反应水稻材料；
分析过表达OsNPR1基因不同株系的抗病性及其它与生长发育有关的表型。
9.完成对Pigm基因的功能鉴定工作；
水稻抗ROD基因的克隆；
水稻抗白叶枯病基因或QTL的定位；
小麦抗锈病QTL的定位工作；
抗黄萎病相关基因的定位工作；
新型等位基因的克隆：
克隆水稻PID3基因以及小麦Yr10、Yr18和Yr36的新型等位基因；
小麦EDR1和EDR2基因的获得；
10.构建xa5-Xa21-Pid2-Pid3聚合载体和Yr10-Yr18-Yr36聚合载体（自然表达，即使用自身启动子）；
开展广谱抗病品种的转基因及分子育种工作，水稻抗病基因的分子标记聚合育种：
利用基因标记，将水稻xa5、Xa21、Pid2和Pid3基因转育我国超级杂交稻的恢复系亲本93-11和明恢系列的品种；
水稻Pigm与Pi9基因重组位点的创建；
小麦抗条锈病基因的分子标记聚合育种：
利用基因标记，将小麦Yr10、Yr18和Yr36基因转育我国小麦主产区品种“济麦19”和“郑麦9023”。
1.分离鉴定PTI途径基因1-2个；
分离鉴定ETI途径基因1-2个；
克隆病原菌效应蛋白基因1-2个；
得到与MEKK1结合的候选蛋白；
鉴定抗病蛋白下游组份1-2个；
明确植物抗病蛋白结构与功能的关系。
2.明确两种Xoo/XocPAMPs突变体对水稻致病性的变化；
明确Xoo/Xoc鞭毛蛋白和另外一种PAMPs诱导水稻的防御反应的能力；
构建3-5个水稻转基因载体。
3.筛选到5个组成型抗病突变体的相关抑制子；
建立SAR筛选体系；
完成对SARD1及SARD2的生化功能分析；
筛到多个spi感病突变单株。
4.得到宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染中、晚期的动态转录组；
利用基因组方法分析RDV病毒感染后水稻基因组的变化。
5.明确拟南芥中参与抗病的表观遗传途径相关蛋白；
明确Xoo诱导或抑制水稻表达的特异小RNA和mRNA；
获得针对RDR2，DCL3，DCL1，DCL4，AGO1和AGO4等的RNAi突变体株系。
6.筛选并获得水稻LPS非敏感型突变体；
建立筛选LPS结合蛋白的生化体系并开展筛选工作。
7.分析乙烯对水稻抗抗病性的作用，构建相应的水稻研究株系。
8.构建水稻OsNPR1基因的遗传学研究株系并进行表型鉴定；
获得水稻抗ROD基因转基因功能验证材料；
定位克隆2个以上水稻抗白叶枯病基因或QTL；
发表关于Pigm基因功能的相关论文。
9.精细定位抗锈病QTL；
克隆2个抗黄萎病相关基因。
10.获得小麦EDR1和EDR2基因各1个；
克隆水稻PID3和小麦Yr10、Yr18和Yr36新型等位基因3-5个。
11.获得一批广谱抗病转基因或分子育种品系；
获得1000份携带水稻PID3或小麦Yr10、Yr18、Yr36等基因的材料。
12.构建xa5-Xa21-Pid2-Pid3聚合载体和Yr10-Yr18-Yr36聚合载体各1个。
13.获得有10万个体的F2群体，筛选获得鉴定Pigm和Pi9基因的菌株2-3个，特异鉴别这两个基因的PCR分子标记2-3个。
14.发表SCI文章10篇左右。
15.申请专利5-6个。
二
1.PTI通路新基因的克隆、鉴定；
PRR受体蛋白互作蛋白筛选。
2.Xoo鞭毛蛋白/解毒蛋白的分离纯化及生化分析；
效应蛋白对宿主信号通路的作用分析；
抗病蛋白不同结构域间互作分析，及这种互作与蛋白功能和下游信号通路之间的关系分型；
构建大麦表皮细胞富集百分病菌转录本的酵母双杂交cDNA文库的构建。
3.利
升级会员 