免疫组化的原理和步骤Word下载.docx

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＊高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度.

-对抗原的要求：

纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

（二）抗原（antigen，Ag）

*抗原的概念：

凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。

抗原具有两个方面的特性：

-免疫原性：

引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；

—免疫反应性：

抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

＊根据抗原是否显示免疫原性分为：

-完全抗原：

分子量较大,一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；

脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

—半抗原：

又称为不完全抗原,分子量较小。

例如：

某些短肽、多糖、类脂和药物等。

＊半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载体：

通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团—NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。

结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

（三）抗体（antibody，Ab）

1、抗体的概念:

＊机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内；

—抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：

单克隆抗体和多克隆抗体。

*单克隆抗体:

是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的.

-特异性强、抗体产量高。

＊多克隆抗体：

是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

—特异性低，会产生抗体的交叉反应.

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。

-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒.

3、抗体的制备--多克隆抗体的制备

＊动物的选择

＊佐剂（adjuvant）

＊免疫方法

*免疫剂量

＊抗体效价的测定

*放血或定期抽血

（1）动物的选择

选择什么动物来免疫取决于:

*所需抗血清的量

—小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升.

＊能供免疫用的抗原量

-小鼠50μg足够，而山羊需要几毫克。

（1）动物的选择（续）

*动物的品系：

免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。

-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。

-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔,年轻，健壮，体重在2.5kg左右,雄性）为最常用。

（2）佐剂（adjuvant）

*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。

佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。

因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。

＊最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：

—弗氏不完全佐剂（Freund’sincompleteadjuvant）

-弗氏完全佐剂（Freund'

scompleteadjuvant）

弗氏不完全佐剂

（Freund'

sincompleteadjuvant,FIA）

＊是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成,比例为1:

1、2:

1、3:

1或5：

1，可根据需要而定，通常2:

1。

＊使用时与水溶性抗原按1：

1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

弗氏完全佐剂（Freund’scompleteadjuvant,FCA）

＊在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml），即成为FCA。

*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:

1混合乳化后（油包水）注入动物。

-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。

佐剂与抗原乳化的方法

＊研磨法:

适于制备大量的佐剂抗原

-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;

缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散.

—按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失.滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

*缺点：

研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。

佐剂与抗原乳化的方法（续）

＊注射器混合法

-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。

*优点：

无菌操作，节省抗原或佐剂。

＊缺点：

不易乳化，时间长.

＊快速乳化法：

利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物.

—将抗原和佐剂按所需量加入一中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎。

-每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右.反复乳化3～4次即可完全乳化。

管内残余量800r/min离心5～10min收集。

简单、快速、节省材料。

乳化剂的鉴定

*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。

（3）免疫方法——免疫途径

*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。

*一般采用多点注射方法

-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。

-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。

（3）免疫方法-—免疫途径（续）

＊几点说明：

-大动物一般不用腹腔注射

-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射

-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100μg抗原即可获得较好的免疫效果。

-皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入。

（3）免疫方法——次数及间隔时间

＊次数一般为2~3次（初次免疫和加强免疫）

—首次注射后，10~15天再加强注射;

—剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂.

*间隔时间，一般而言,动物越大，间隔越长

—豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；

—第三次注射的间隔时间更长些，效果更好.

举例1：

家兔的免疫

*初次免疫

—用50～200μgAg加入FCA，在背部皮下注射6～8点,每点0。

1～0。

2ml,也可肌肉内或皮内注射；

＊两周后，加强免疫

-将50～200μgAg于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；

＊抗体效价的检测：

加强免疫一周后，耳缘静脉采血

-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。

前者抗体效价在1：

4000以上，后者在1：

16以上,即可采血,取血清进一步提纯。

举例2：

微量抗原淋巴结内注射免疫家兔

*一般选择2。

5～3。

0kg的新西兰种公兔

-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；

—10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；

—以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为25～50μg；

-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:

128）。

举例3：

豚鼠和大鼠的免疫

—用10～100μgAg加入FCA，在背部皮内注射4～6点,每点0。

lml，也可肌肉内或皮下注射；

＊加强免疫

—每隔7～8天,将10～50μgAg于PBS或FIA中。

在肌肉、皮下或静脉注射；

*抗体效价的检测

（4）免疫剂量

＊抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制;

*免疫周期长的动物可少量多次注射,短的可大量少次。

（4）免疫剂量（续）

*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量

（5）抗体效价的检测

多采免疫双向扩散法

【基本原理】

＊指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线.

—将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。

*优缺点:

简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。

免疫双向扩散法的操作步骤

＊将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。

＊将1%agar融化后，置56℃水浴。

*在玻璃板上铺胶，约1.5mm厚,凝固后打孔（直径3rnm）,孔间距10mm。

*中心孔加5μl抗原样品,周围孔内每孔加5μl抗血清（抗体预先作系列倍比稀释即1：

2、1:

4、1：

8、1：

16、1：

32等比例）。

*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。

*观察结果。

抗体效价检测的其它方法

＊环状沉淀试验，需较多的抗血清,现已很少用;

＊对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；

＊酶联免疫吸附试验（ELISA）。

放血或定期抽血

常用以下3种方法

＊颈动脉放血法：

放血量较多,动物不易中途死亡。

2.5kg白兔可放血约80ml。

家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。

＊心脏采血法：

常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。

＊静脉采血:

家兔可用耳缘静脉采血；

山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液。

放血或定期抽血（续）

＊采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血

*血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白（例如蛋白水解酶）将污染抗体并将抗体水解，降低效价；

*加叠氮化钠，分装,低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。

二、组织和细胞标本的制备

＊标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件

*免疫组化对组织和细胞标本的要求

-保持所检标本原有的结构、形态；

-在原位最大程度地保持待测抗原（或抗体）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。

＊免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项.

—各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验的最佳方法。

免疫组化中常用的组织和细胞标本

＊组织标本

-石蜡切片

-冰冻切片

*细胞标本

-组织印片

—片（细胞爬片）

—细胞涂片

（一）石蜡切片

＊石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法

-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；

-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

＊石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。

1、取材的特殊要求及注意事项

*标本新鲜：

一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散.

＊取材部位:

除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照.

-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。

1、取材的特殊要求及注意事项（续）

*避免挤压:

取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；

-镊取组织动作要轻；

—经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。

2、固定及常用的固定液

＊取材后的组织需立刻投于固定剂中

—固定使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；

—对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

*常用固定液：

固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类.其固定原理不同，各有优缺点。

—醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

—醇类（常用乙醇）

-其它（丙酮）

（1）醛类

＊甲醛（福尔马林）应用最广

-原理：

形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

-优点：

形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少.

-缺点：

*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；

*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;

*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

—注意事项：

＊缩短固定时间，降低固定温度（4︒C）,为此组织块不宜过厚。

＊改用中性缓冲福尔马林，以pH值7。

2～7.40.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

＊固定后充分水洗以减少分子间交联。

*切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现（抗原修复）。

＊戊二醛:

—穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

＊多聚甲醛（常用4％）：

—可用于免疫电镜；

也可用于免疫荧光染色.

＊主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等。

（2）醇类

*最常用的醇类固定剂是乙醇。

-其固定作用：

使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

—优点：

穿透性强、抗原性保存好。

—缺点：

＊脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长（2h内）。

*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；

染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

（3）其它固定剂

*丙酮：

-对抗原性的保存好，但脱水性更强,较少用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定.

3、抗原修复——原因

＊常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：

—抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；

—蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

*要求：

在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

3、抗原修复—-方法

＊化学方法

*加热方法

—水浴加热法

-微波照射法

-高压加热法

—酸水解法

（1）化学方法

*主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。

常用的酶有：

胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

—胰蛋白酶：

一般使用浓度为0。

05％～0.1％，消化时间为37︒C,10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；

-胃蛋白酶：

1%～0.4％，消化时间为37︒C、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。

＊例如：

Laminin、CollagenIV

（2）水浴加热法

*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。

操作简单、经济，适用于所有的实验室,

对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。

（3）微波照射法

＊将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟,冷却后，按免疫组化染色步骤进行。

＊此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。

（4）高压加热法暴露抗原

*将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压

　一、SP三步法

　　1）石蜡切片，常规脱蜡至水.

　　2）0。

3％或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性.

　　3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟

　　4）候选步骤：

采用抗原修复：

微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法.自然冷却，再用3分钟×

3次.

　　5）血清封闭：

室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。

倾去,勿洗。

　　6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2～3小时或4℃过夜（最好复温）.PBS冲洗，3分钟×

5次。

　　7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟—1h。

　　8）PBS冲洗,3分钟×

　　9）滴加SP（链霉亲和素—过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟—1h。

10）PBS冲洗，3分钟×

5次.

　　11）显色剂显色（DAB等）。

　　12）自来水充分冲洗。

　　13）可进行复染,脱水,透明。

14）选择适当的封片剂封片。

二、即用型二步法

　　1）脱蜡、水化组织切片。

　　2）根据所应用的一抗的特殊要求,对组织切片进行预处理。

　　3）0.3％或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。

　　4）滴加一抗,室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜,PBS或TBS浸洗3分钟×

　　5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×

　　6）滴加通用型IgG抗体—Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h,PBS/TBS冲洗，3分钟×

　　7）应用DAB溶液显色。

8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片