免疫组化的原理和步骤Word下载.docx

1、高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度. -对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。（二） 抗原 （antigen， Ag） *抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原：分子量较大,一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。半抗原：又称为不完全抗原,分子量较小。例如

2、：某些短肽、多糖、类脂和药物等。半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载 体 ：通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。（三）抗体 （antibody， Ab） 1、抗体的概念:机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生

3、特异性结合的球蛋白，被称为抗体。-抗体主要存在于血清内；抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的. -特异性强、抗体产量高。多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。特异性低，会产生抗体的交叉反应. -多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合，要

4、求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒. 3、抗体的制备-多克隆抗体的制备 动物的选择 佐剂（adjuvant） 免疫方法 *免疫剂量 抗体效价的测定 *放血或定期抽血 （1） 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于:*所需抗血清的量 小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升. 能供免疫用的抗原量 -小鼠50g足够，而山羊需要几毫克。（1） 动物的选择（续） *动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔,年轻，健壮，体重在2.5kg左右,雄性）为最常用。（

5、2） 佐剂 （adjuvant） *一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant） -弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant） 弗氏不完全佐剂 （Freunds incomplete adjuvant, FIA） 是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或5：1，可根据需要而定，通常2:1。使用时与水溶性抗原按1：1

6、比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂 （Freunds complete adjuvant, FCA） 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为220mg/ml），即成为FCA。*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后（油包水）注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法 研磨法:适于制备大量的佐剂抗原 -先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散. 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失.滴

7、加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法（续） 注射器混合法 -将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。缺点：不易乳化，时间长. 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物. 将抗原和佐剂按所需量加入一中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎。-每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右.反复乳化34次即可完全乳

8、化。管内残余量800r/min离心510min收集。简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定 *判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。（3） 免疫方法免疫途径 *常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法 -常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。（3） 免疫方法-免疫途径 （续） 几点说明：-大动物一般不用腹腔注射 -颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 -抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100g抗原即可获得较好的免

9、疫效果。-皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入。（3） 免疫方法次数及间隔时间 次数一般为23次（初次免疫和加强免疫） 首次注射后，1015天再加强注射;剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂. *间隔时间，一般而言,动物越大，间隔越长 豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；第三次注射的间隔时间更长些，效果更好. 举例1：家兔的免疫 *初次免疫 用50200g Ag加入FCA，在背部皮下注射68点,每点0。10。2ml,也可肌肉内或皮内注射；两周后，加强免疫 -将50200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静

10、脉采血 -抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1：4000以上，后者在1：16以上,即可采血,取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔 *一般选择2。53。0kg的新西兰种公兔 -先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为2550g；-末次注射两周后兔耳放血测价 （可达1:128）。举例3：豚鼠和大鼠的免疫 用10100g Ag加入FCA，在背部皮内注射46

11、点,每点 0。lml，也可肌肉内或皮下注射；加强免疫 每隔 78天,将1050g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；*抗体效价的检测 （4） 免疫剂量 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制;*免疫周期长的动物可少量多次注射,短的可大量少次。（4） 免疫剂量 （续） *各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量 （5） 抗体效价的检测 多采免疫双向扩散法 【基本原理】 指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线. 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点:

12、简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。免疫双向扩散法的操作步骤 将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。将1%agar 融化后，置56水浴。*在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚,凝固后打孔（直径 3rnm）,孔间距10mm。*中心孔加5l 抗原样品,周围孔内每孔加5l 抗血清（抗体预先作系列倍比稀释即 1：2、1:4、1：8、1：16、1：32等比例）。*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。*观察结果。抗体效价检测的其它方法 环状沉淀试验，需较多的抗血清,现已很少用;对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；酶联免疫吸附试验 （ELISA）。放血或定期抽血 常用以下3种方

13、法 颈动脉放血法：放血量较多,动物不易中途死亡。2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。静脉采血:家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液。放血或定期抽血 （续） 采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血 *血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白（例如蛋白水解酶）将污染抗体并将抗体水解，降低效价；*加叠氮化钠，分装,低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。二、组织和细胞标本的制备 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件

14、 *免疫组化对组织和细胞标本的要求 -保持所检标本原有的结构、形态；-在原位最大程度地保持待测抗原（或抗体）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项. 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本 组织标本 -石蜡切片 -冰冻切片 *细胞标本 -组织印片 片（细胞爬片） 细胞涂片 （一） 石蜡切片 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 -最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；-

15、石蜡块还能长期存档，供回顾研究。石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事项 *标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散. 取材部位:除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照. -细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。1、取材的特殊要求及注意事项（续） *避免挤压:取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色

16、，因而取材时应使用锋利的刀刃；-镊取组织动作要轻；经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液 取材后的组织需立刻投于固定剂中 固定使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类.其固定原理不同，各有优缺点。醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 醇类（常用乙醇） -其它 （丙酮） （1） 醛类 甲醛（福尔马林）应用最广 -原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组

17、织收缩少. -缺点：*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。注意事项：缩短固定时间，降低固定温度（4C）,为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲福尔马林，以pH值7。27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液，减少固定液pH的变化。固定后充分水洗以减少分子间交联。*切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现（抗原修复）。戊二醛:穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合

18、用作免疫电镜固定液。多聚甲醛（常用4）：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色. 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等。（2） 醇类 * 最常用的醇类固定剂是乙醇。-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。优点：穿透性强、抗原性保存好。缺点：脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长（2h内）。*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。（3） 其它固定剂 *丙酮：-对抗原性的保存好，但脱水性更强,较少 用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定. 3、抗

19、原修复原因 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复-方法 化学方法 *加热方法 水浴加热法 -微波照射法 -高压加热法 酸水解法 （1） 化学方法 *主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。胰蛋白酶：一般使用浓度为0。050.1，消化时间为37C,1040min，主要用于细胞内抗原的显示；-胃蛋白酶：1%0.4，消化时间为37C、30180min，主要

20、用于细胞间质抗原的显示。例如：Laminin、CollagenIV （2） 水浴加热法 *将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。操作简单、经济，适用于所有的实验室, 对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。（3） 微波照射法 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95以上，持续l015分钟,冷却后，按免疫组化染色步骤进行。此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。（4） 高压加热法暴露抗原 *将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水

21、. 2）0。3或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性. 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法.自然冷却，再用3分钟3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去,勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37孵育23小时或4过夜（最好复温）.PBS冲洗，3分钟5次。7）滴加生物素标记的二抗，室温或37孵育30分钟1h。8）PBS冲洗,3分钟9）滴加SP（链霉亲和素过氧化物酶），室温或37孵育30分钟1h。 10）PBS冲洗，3分钟5次. 11）显色剂显色（DAB等）。12）自来水充分冲洗。13）可进行复染,脱水,透明。14）选择适当的封片剂封片。二、即用型二步法 1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求,对组织切片进行预处理。3）0.3或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。4）滴加一抗,室温或37孵育3060分钟，或4过夜,PBS或TBS浸洗3分钟5）滴加enhangcer增强剂，3730min，PBS或TBS浸洗3分钟6）滴加通用型IgG抗体Fab段-HRP多聚体，室温/37孵育30分钟-1h,PBS/TBS冲洗，3分钟7）应用DAB溶液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片