HIV实验室指南全解VOLAB 实验室建设指南Word格式.docx

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还有一种ELISA方法是竞争法。

它的主要特点是酶标记抗体是特异性的HIV抗体。

标本中的HIV抗体与酶标记HIV抗体竞争固相载体上的HIV抗原，操作时同时加入标本和酶标记HIV抗体，如标本中的抗体浓度高，酶标记HIV抗体就不能与固相载体上的HIV抗原结合或结合得很少，显色反应就较弱，相反，如标本中的HIV抗体含量很少或没有，大量的酶标记HIV抗体将与固相载体上的HIV抗原结合，显色反应就很强。

因而在竞争法中，光密度值与标本中的抗体含量呈负相关关系。

这种方法是将标本与酶标抗体同时加入，需时更短，另外这种方法具有较好的特异性。

（2）结果的判断：

ELISA方法是根据临界值（cut 

off 

value, 

CO）判断结果的。

临界值是将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和性结果的界值。

对于间接法和双抗原夹心法，标本OD值与临界值的比值大于等于1（S／CO≥1）为阳性；

对于竞争法，标本OD值与临界值的比值小于等于1（S／CO≤1）为阳性。

2．从尿液中测抗体

尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫测定方法在体外检测尿液中HIV－1抗体。

此法用于实验室辅助临床HIV感染诊断。

在确定标本HIV－1抗体的结果之前，根据美国疾病控制中心推荐的HIV抗体的诊断步骤，此项检测重复阳性的标本，用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western 

Blot试剂盒进行确诊。

近年与血液检查相比，尿液检查有多种优点。

在尿液中一般不存在HIV病毒。

卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western 

Blot试剂盒，可对于尿液EIA重复阳性标本做确认实验。

尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重组的HIV－1表面抗原在尿液中检测HIV－1抗体。

微孔板的孔中包被gp160膜抗原。

把尿液标本或对照与标本缓冲液一起加入孔中温育。

如果标本中存在HIV－1膜抗原的抗体，它们将与孔中的抗原结合。

标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异性结合。

通过洗涤去除未结合的物质。

然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体并温育。

酶联物与孔中结合到抗原的HIV－1抗体结合。

洗涤去除未结合的酶联物，然后加入底物（p-NPP）。

如标本中含有HIV－1抗体，酶将使孔内液体由无色变为黄色，颜色的强度与标本中抗体含量成正比。

反应用EDTA终止，用酶标仪在405nm处测吸收峰而读取结果。

试剂盒中包括阳性及阴性对照，每板应做2个阳性对照及3个阴性对照，将阴性对照平均吸收值加0.18得到cutoff值，标本是通过与Cutoff值比较来判断是否为阳性或阴性。

第一次检测阳性标本应用同一标本再重复检测，如果重复检测仍为阳性，标本为重复阳性标本。

重复阳性标本用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1Wester 

Blot试剂盒进一步确认。

3．胶体金法检测HIV1/2抗体实验

胶体金法检测HIV抗体是一种不需要任何仪器设备的血清／血浆检测法，它利用免疫层析分析原理来快速检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，从而用于判断人体是否受到HIV1型／HIV2型病毒感染。

（1）方法和原理

试剂盒采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的重组HIV抗原和质控区（C）的抗-protein 

A抗体。

测试时，血标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血标本中的HIV抗体与预包被在膜上的protein 

A胶体金结合物反应。

然后，混合物随之在毛细管向上层析，在测试区（T）与固定在膜上的重组HIV抗原反应。

如果血清中含有HIV－1抗体或HIV－2抗体，在测试区内（T）会出现一条红色条带，表明是阳性结果。

如果在测试区内（T）没有出现红色条带，则血清中不含有HIV抗体，表明是阴性结果。

无论HIV抗体是否存在于血清中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），质控区的抗Protein 

A与Protein 

A胶体金结合物反应出现一条红色条带。

质控区内（C）所显现的红色条带是判定是否有足够血标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

（2）结果判定

阳性（＋）：

两条红色带出现。

一条位于测试区内（T），另一条位于质控区内（C）。

阴性（－）：

仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区内（T）无红色条带出现。

无效：

质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

在任何情况下，应重新测试。

如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。

注意：

由于样本中HIV抗体滴度的不同，测试区（T）内的红色条带会显现出不同深浅的颜色。

但是，本试剂盒的测试结果不能做为判定样本中抗体滴度高低的依据。

4. 

明胶颗粒凝集试验

明胶颗粒凝集试验（PA）是一种快速的HIV血清抗体的检测方法。

先将样品稀释，然后加入包被抗原的明胶颗粒，混匀后保温（一般为室温）。

由于操作方便，且无需特殊仪器设备，很适合于对少量标本的检测。

当血清或血浆中有HIV抗体存在时，经HIV抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原—抗体相互作用，产生肉眼可见的凝集反应。

（1） 

操作方法

① 

待测血清从1：

4开始作倍比稀释。

② 

1：

8血清稀释孔加25μ1非致敏粒子，1：

16血清稀释孔加25μ1致敏粒子。

③ 

设置阳性对照血清，使其终末滴度为1：

128。

④ 

振荡混匀，加好盖板，室温（20℃）静置2小时观察结果

（2）结果观察

明胶颗粒沉积在孔底，周边平滑，或形成致密圆圈为阴性结果；

孔底呈现均匀的凝集现象，或形成一个大的边缘不整齐的圆圈，为阳性结果。

（3）注意事项

标本应为新鲜标本，无溶血。

若标本与致敏粒子、非致敏粒子均出现反应，应将标本先和非致敏粒子吸附，然后再作检测。

孔号

1

2

3

待检血清

血清稀释液

未致敏颗粒

致敏颗粒

稀释度

4

1 

:

16

32

（三）、确证（确认）试验

确证（确认）试验主要用蛋白印迹试验（Western 

Blot, 

WB）。

蛋白印迹法是将HIV病毒蛋白用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS-Polyacrylamide 

Gel）电泳。

将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维膜上。

将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。

将待检血清样品用稀释液稀释成1：

100，再把它直接放到硝酸纤维膜上，并静置一段时间，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与硝酸纤维膜条上的抗原带相结合。

经过冲洗去掉未结合的多余抗体，并加入抗人－IgG酶结合物，洗去未结合的抗人－IgG酶结合物，加入底物，即可使有反应的抗原、抗体结合条带呈现紫褐色，这表示阳性反应。

此法一般是在ELISA或其它初筛检测阳性后再用来确认。

1、 

结果判断

a、膜条没有条带出现表示阴性

（一）

b、待检标本出现条带的色度小于弱阳性对照gp120带色度时表示可疑（±

）。

c、待检标本出现的条带色度相当于弱阳性照gp120带色度但比强阳性条带的色度弱时表示（+）。

d、待检标本出现的条带色度相当于或大于强阳性对照gp120带色度时表示（++）。

GAG 

P55 

， 

P24， 

P17

ENV 

gp160, 

gp120, 

gp41

POL 

p65, 

p51, 

p32

（1）以上三个基因组里各出现任何一条带，而且其色度在“+”或“±

”以上者表示阳性。

最近，美国CDC规定：

在P24，gp41,gp120/gp160四条带中出现任何二条带者表示阳性。

（2）有一个或多个条带但不符合阳性标准者表示可疑。

（3）未出现任何条带者表示阴性。

2、注意事项：

a、每次反应之间，要充分洗净。

b、反应条件是室温20-30℃。

c、试剂条只能用镊子夹取，不能用手接触。

d、每次试验需设强阳性、弱阳性和阴性对照。

（四）检验程度

初筛试验每一次检测阴性者可报告阴性，若第一次检测阳性，则需进行复测，复测时（最好用不同类型的试剂）可同时测定两孔，判定方法如下：

第一次检测 

第2次检测 

结果判定

（-） 

阴性

（+） 

（-）（-） 

（+）（-）/（+） 

阳性

初筛阳性的标本不能发报告，必须将血样或血袋送本省（本市）艾滋病监测检验中心确认实验室进一步做确证试验。

确证试验阳性者，由省（市）监测中心给送检单位发出抗-HIV阳性报告，同时上报卫生厅（局）和卫生部疾病控制司备案。

确认试验阳性和可疑的血袋均需送确认实验室妥善处理，绝对不能发出使用。

三、PCR在HIV检测中的应用

聚合酶链反应技术（Polymerase 

Chain 

Reaction,PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是近年来发展起来的一种的短时间内大量扩增特定DNA片段的新技术。

应用该方法，可很容易地查到原先那些由于DNA拷贝数少而不足以检测出来的病毒DNA或其它致病基因，从而大大地推动了疾病的DNA诊断和分子克隆基因组DNA工作的发展。

由于该项技术可将极微量的DNA特异地扩增上百万倍，甚至能检测到单分子或每10万个细胞中仅含1个DNA分子的样品。

它是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特性是由两个人工合成的引物序列决定的。

所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。

待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。

此时，两引物的3’端相对，5’端相背。

在合适条件下，由TaqDNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。

这种实验过程是在温度控制下进行的，一个变性--复性--延伸的过程就是一个PCR循环。

PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复；

延伸的产物经第二循环变性，亦与引物互补，作为引物引导DNA合成的新模板；

因此，第二循环后延伸的模板由第一循环的4条增为8条，依此类推，以后每一个循环后的模板均比前一个循环增加1倍。

理论上讲PCR扩增DNA产量是呈指数上升的。

PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速、简便、对起始材料质量要求低等特点。

PCR用于检测HIV的优点如下：

1.与传统检测抗体的方法相比，其灵敏度和特异性更高，从而对HIV的定量检测提供了有效的手段；

2.不依赖于宿主的免疫反应，无须等到免疫系统对HIV产生抗体后才能检定宿主受HIV感染的状态，这有利于对血清阳转以前标本的检测和对阳性母亲所生婴儿的HIV感染的调查；

3.对潜伏状态的HIV的检测不依赖于HIV在宿主细胞的生长活性。

综上所述，PCR是对HIV核酸检测的有效手段，是对HIV病毒分离、血清学抗体检测方法的必要补充。

在HIV感染的确诊和艾滋病诊断中，核酸的检测对病原活动的监控更加有效方便，因为核酸复制的有无和数量是体内病毒复制情况的直接反映。

多聚酶链式反应（PCR）主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。

此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。

四、艾滋病病原学诊断中的几个问题。

1、明确不同实验方法的意义和适应范围：

HIV血清学检测分为初筛和确证两类。

初筛实验出现的阳性结果，应再次重复实验，若仍为阳性，则应用确证实验去证实，只有确证实验是阳性的标本方可报告为HIV抗体阳性。

另外，能引起艾滋病的病毒分为两型，即HIV-1和HIV-2，两型病毒间只有少部分抗原有交叉（主要是Gag基因编码的核蛋白）。

因而各型病毒试剂只能有效地检测出同型病毒的抗体。

2、针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段。

HIV原发感染后的两周内，用任何方法均无法查到病毒的存在，2周后出现病毒血症，此时可用抗原检测方法、检查病毒抗原或测定病毒逆转录酶活性，而不能用血清学方法，因为抗体要到感染后6-8周才会出现。

此后就只能用抗体检测方法，直到艾滋病的出现，因为在这段时间HIV抗原很难从血清中查到，待发展到艾滋病阶段时才会重新出现。

3、HIV抗体测定的灵敏度、特异度和预测值：

表1 

HIV抗体测定的灵敏度、特异度和预测值

检验结果

抗体情况

总 

计

有

真的

阳性（a）

无

假的

阳性（b）

所有阳性

试验（a+b）

阴性（c）

都有抗体

阴性（d）

都无抗体

所有阴性

试验（c+d）

（a+c）

（b+d）

（a+b+c+d）

敏感性：

是指在有抗体存在的标本中，检出抗体的准确性。

敏感性低的试验将有许多假阴性。

敏感性=a/a+c

特异性：

是指在没有抗体存在的标本中，检测其抗体缺失的准确性。

特异度低的试验将有许多假阳性。

特异性=d/b+d

理想的是，一种试验应当具有100%的敏感性和100%的特异性。

但实际上，没有一种生物试验能满足这样的要求。

但在敏感性和特异性最高的试验方法当中现行的HIV检测方法还是可取的，在理想的实验室条件下，许多市售的HIV抗体试验方法的敏感性和特异性都在99%以上。

除非由于检验人员造成人为误差，这种检验方法所固有的特性是不会出现明显改变的。

阳性试验预测值（PPV）a/a+b

阴性试验预测值（NPV）d/c+d

试剂的敏感性和特异性可以衡量它的优劣，但并不能决定一个测定结果正确与否的可能性大小，后者是由测定的预测值决定的。

一个测定的阳性或阴性预测值，即这个阳性或阴性的结果是真阳性或真阴性的可能性。

这除与所用试剂的优劣有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。

如表2所示，一个阳性HIV血清检测结果的真实性，对旧金山同性恋人群可高达99.88%，而对正常人则为18.94%，反之，一个阴性结果的真实性对前者不足90%，而对后者则高达99.997%。

表2 

ELISA法HIV-1抗体测定的预测值

人 

群

预 

测 

值

阳 

性

阴 

旧金山同性恋人群

99.88

89.06

美国非高危人群

18.94

99.997

因而我们在实际检测工作中，对我国普通公民初筛试验结果阴性的预测值是非常高的,即可初步排除HIV感染的可能性，而出现阳性结果，则必需慎之又慎，要严格经蛋白印迹等确定实验证实后方可报告。

相反，对来自疫区的外国人或在疫区长期居住的归国人员可疑阴性结果，则不能轻易放过，以免因漏诊而造成严重的后果。

4、 

HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率

许多HIV抗体检测方法除了是一种定性实验外，还同时是一种半定量实验。

这可表现于测定不同稀释度的血清的反应性，得出阳性血清的最高稀释度，而ELISA方法则可根据光密度（0D）值的强度直接确定。

反应性越强的血清，含有HIV抗体的可能性也就越大。

例如，表3中的HIV感染率为30/10万的正常献血员，中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1.13%，而在高强度反应时该概率则激增到86.1%，与同样强度的来自HIV感染率极高的吸毒人群（45000/10万）的概率相近。

表3 

HIV感染机率与ELISA反应强度的关系

群 

HIV感染率 

ELISA反应强度（%）

（ 

/10万） 

低 

度 

中 

高 

度

非高危献血员 

30 

0.0007 

1.13 

86.1

高危献血 

95 

0.0022 

3.48 

95.2

军 

150 

0.0036 

5.39 

96.9

吸毒者 

45000 

1.91 

96.6 

99.9

注：

数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率（%）；

（2） 

低度为OD<

1，中度为1<

OD<

6，高度为OD>

6。

5、检测结果的处理，如果在HIV检测中发现了阳性结果，一方面应立即按国家法定乙类传染病上报程序迅速上报。

对已成年患者应通知本人，并向其说明阳性检测结果的意义以及HIV感染与艾滋病之间的关系，同时还要忠告他（她）有义务不从事可将病毒传给他的活动。

另一方面，检测单位也有责任为患者保密，以使其在原来的环境中生活下去。

这不仅仅是出于对患者的人道，避免因无知而产生的歧视，同时也是有效控制艾滋病蔓延的重要保证。

可以想象，如果艾滋病病人或HIV感染者一经发现，就被赶出单位、学校、家庭，还会有谁再来做检侧。

这样势必会使携带HIV的人潜伏于社会无法被发现，艾滋病将传播得更快、更广。