DNA含量及S期细胞比值与肺癌生物学特性的关系文档格式.docx
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肺癌SPF与肿瘤分期、转移呈正相关关系（）；
随临床分期增加，SPF均相应增加（）。
结论DNA含量改变、增殖活性的增加在肺癌组织中具有普遍意义。
肺癌组织增殖活性越高，肿瘤转移的潜能越大。
肺癌组织的FCMDNA含量及细胞增殖活性测定有助于进一步研究肺癌的生物学行为。
关键词：
肺癌；
RelationofFCMDNAcontentandSphasefractiontothebiologicalcharacteristicsoflungcancer
ABSTRACT:
ObjectiveToinvestigatetherelationofDNAcontentandSPFtotheclinicopathologicalcharacteristicinlungcancer.MethodsFreshspecimenstakenfrom56patientswithlungcancerand36patientswithnonmalignantpulmonarylesionsweremeasuredforDNAindex（DI）,Sphasefraction（SPF）byusingFACSCalibur4200flowcytometry.Results①DNAindex（DI）oflungcancerwas±
±
inlungcancerandnonmalignantgroups,respectively.Thepercentageofheteroploidwas%inlungcancer,%innonmalignant.DIandthepositiverateofheteroploidweresignificantlyhigherinlungcancergroupsthanthatinnonmalignantgroup（）;
②AthoughDIincreasedasthepathologicalgradeandTNMstageadvanced,therewerenosignificantdifference（）;
③ItwasdemonstratedthatSPFwassignificanthigherinlungcancergroupsthanthatinnonmalignantgroup.TheSPFofheteroploidtumorswashigherthanthatofdiploidtumors（）;
SPFcorrelatedwithTNMstageandlymphnodeanddistantmetastasis（）.WiththeincreaseofTNMstage,theSPFincreased（）.ConclusionTheincreaseofDNAcontentandproliferationabilityimprovementwerecommoninlungcancer;
Withtheproliferationabilityimprovement,thetendencyofmetastasisincreased;
AnalysisofDNAcontentandSPFbyFCMprovidabeneficialmethodfortheevaluationoftumorbiologicalbehavior.
KEYWORD:
lungcancer;
flowcytometry;
DNAcontent;
biologicalcharacteristic
恶性肿瘤的染色体变化是肿瘤的基本生物学特征之一。
研究表明，人类大多数肿瘤细胞的染色体都有异常，表现为染色体结构和数目的异常。
异倍体的出现是恶性肿瘤的特征之一[12]。
在细胞恶变过程中因染色体的畸变使细胞DNA含量发生改变，其在肿瘤的发生、发展、转移和预后中均具有重要意义。
本研究对56例肺癌及36例肺非癌性病变的新鲜组织进行流式细胞仪（FCM）DNA含量、S期细胞比值（Sphasefraction,SPF）测定，并分析DNA含量、SPF与肺癌临床病理指标的关系。
1材料与方法
观察对象选择2002年3月至2002年12月在我院手术切除和经纤支镜活检的肺癌标本共56例（手术切除的肺癌标本15例，经纤支镜活检的肺癌标本41例），其中男性44例，女性12例。
年龄30-78岁，平均55岁。
病理类型：
鳞癌33例、腺癌11例、小细胞癌12例。
术前均未行任何放、化疗。
TNM分期：
Ⅰ期2例、Ⅱ期20例、Ⅲ期23例、Ⅳ期11例。
36例非癌性病变（手术切除标本15例，经纤支镜活检标本21例），其中男性17例，女性19例。
年龄13-69岁，平均46岁。
均经病理检查证实为非癌性病变，其中符合结核肉芽肿10例，血管瘤2例，炎性假瘤6例，支气管黏膜慢性炎15例，鳞状化生2例，黏膜急性炎1例。
主要仪器与试剂OLMPUSBP40纤支镜（日本），OLMPUSCLEIU冷光源（日本），FACScalibur流式细胞仪（美国BD公司），分析用Macintosh计算机（美国苹果公司），Allegra21R台式低温离心机（美国Coulter公司）。
PBS缓冲液（美国Beckmancoulter公司），组织培养液（美国BD公司），溶血素（美国BD公司），DNA试剂盒（美国BD公司）。
实验方法
样本制备由手术切除和经纤支镜活检的新鲜标本约，立即置培养液中4℃冰箱保存，于1h内制成单细胞悬液（flowcytometry,FCM）备DNA检测。
所有患者同时同部位另取标本置10%（体积分数）甲醛溶液中固定送病理检查。
流式细胞术DNA含量及细胞周期分析将手术或纤支镜所取标本离体后立即置2mL培养液中，将组织用锐利的剪刀切碎至1mm大小，放在180目铜网上轻搓，边搓边以PBS液缓慢冲下，收集细胞悬液，以1000r/min离心沉淀5min，去上清液，加入溶血素2mL作用10min，PBS漂洗2次，离心沉淀（1000r/min，5min），弃上清液，加入95%（体积分数）冰乙醇，配成终浓度为70%的细胞悬液固定，置4℃冰箱待检。
测定前用PBS洗涤3次，弃上清液，加入A溶液250μL（内含30mg/L胰蛋白酶）混匀后静置10min，再加入B溶液（内含100mg/LRnaseA）200μL，混匀后静置10min，最后加入C溶液200μL，混匀后避光静置10min，调整细胞浓度为1×
106，上机检测。
使用流式细胞仪进行样本检测，测定前使用标准微球校准仪器的CV值在3以内。
分析指标以DNA指数（DI值）表示DNA含量，依据DI值判定DNA倍体，≤DI≤为DNA二倍体；
或为异倍体。
DNA异倍体的判定：
在DNA直方图上出现明显的两个峰且异倍体细胞群至少应含5%-10%的细胞或核同时或。
同时测定SPF。
DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常二倍体细胞G0/G1峰道数
SPF（%）=[S÷
（G0/G1+S+G2M）]×
100%
病理切片的制备以常规石蜡切片程序制片，HE染色,由病理诊断医师按照WHO肺癌国际组织学分类标准,对肺癌的细胞类型、分化进行分类。
统计学处理应用统计软件包进行统计学处理，两样本均数间比较采用t检验，两样本率间比较采用χ2检验。
相关分析采用spearmans法。
应用单因素方差分析（OneWayANOVA）比较肺癌各细胞类型、临床分期、病理分级间DI、SPF的差异，两两比较采用LSD法。
2结果
不同类型组织DNA含量和增殖性56例肺癌病变组织DI为，平均为±
；
SPF为，平均为±
DNA异倍体阳性率为%（44/56）；
CV值,平均±
。
36例非癌性病变组DI，平均为±
SPF，平均为±
DNA异倍体阳性率为%（2/36），CV，平均±
肺癌组与非癌性病变组相比，DI、SPF、DNA异倍体阳性率差异有统计学意义（）。
56例肺癌中，二倍体肺癌组SPF平均为±
异倍体肺癌组SPF平均为±
，两组比较差异有统计学意义（）。
肺癌组织DNA含量、增殖性与肺癌组织学类型、组织分化程度以及临床TNM分期的关系56例肺癌中小细胞肺癌者12例,DI、SPF平均为±
、±
非小细胞肺癌44例，DI、SPF平均为±
，两组相比差异无显着性（）。
44例非小细胞肺癌中有8例由于取材原因组织分化程度难以判定，仅对其中36例进行分析：
高-中分化共11例（高分化8例、中分化3例），低分化25例。
随组织分化程度降低DI、SPF有增高的趋势，但两组相比差异无显着性（）。
56例肺癌DI随肿瘤TNM分期增加有增加的趋势，但各组间差异无显着性；
肺癌各临床分期SPF分别为：
Ⅰ-Ⅱ期±
、Ⅲ期±
、Ⅳ期±
随临床分期增加SPF相应增加，差异有显着性（）；
SPF与肺癌临床分期、TNMN、TNMM有相关关系（r=，r=，r=，）。
肺癌组织DNA含量、增殖性与肺癌患者年龄、吸烟史以及肿瘤部位无明显关系。
3讨论
DNA是染色体的主要成分，人体除少数增生代谢活跃的组织外，正常体细胞均为恒定的二倍体DNA含量。
在细胞癌变的过程中，由于染色体的畸变，使细胞DNA含量也随之改变。
在本实验中，56例肺癌组织的DNA含量远较非癌性病变组为高，从而证实了恶性细胞的DNA含量高于正常细胞，DNA异倍体的出现是癌变的重要标志[1]。
在本实验中，尚有%的肿瘤DNA倍体分析为正常二倍体DNA含量，原因可能与以下因素有关：
①二倍体肿瘤，大量研究表明少数的肿瘤细胞可以表现为正常二倍体的DNA含量；
②一些肿瘤可能同时存在染色体的丢失和复制，DNA的净含量未发生变化,异倍体无法检出来；
③肿瘤细胞的异质性，造成DNA含量分布不均[34]；
④相对于二倍体来讲，异倍体细胞极少，在进行流式细胞仪检测时DNA异倍体峰被二倍体峰掩盖。
本组资料显示DI与肺癌部位、吸烟、病理类型、临床分期等指标间未见相关性，与Tinnemans、Pina结果相似。
提示染色体的不稳定性、细胞DNA含量增高持续存在于肺癌发生、发展的各个时期。
另有学者认为DI与肺癌临床分期、病理分化程度密切相关，考虑其差别可能与病例的选择、样本大小以及取材等因素有关。
此外，本组资料显示，反映细胞增殖活性的指标SPF在癌性组织中明显高于非癌性组织，且SPF与临床分期、肿瘤淋巴结转移（TNMN）、远处转移（TNMM）相关。
随肺癌临床TNM分期的增加，SPF均相应增加并有统计学差异。
提示良恶性组织间存在明显的增殖能力的差别，恶性组织的增殖能力明显高于非癌性病变，肺癌组织的增殖能力与肿瘤分期、浸润、转移等预后因素相关，高增殖状态的肺癌具有更大的转移潜能。
本组资料显示异倍体肿瘤SPF较二倍体肿瘤高。
提示恶性肿瘤间增殖能力是有差别的，相对于二倍体肿瘤，异倍体肿瘤增殖活性更高、分裂期的细胞数目
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