届生物技术学试题与答案Word下载.docx
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仅是天然产物活性的10％；
166个氨基酸，在17、41、141位有三个胱氨酸，天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差；
Cys17（-SH）点突变为丝氨酸（-OH）,IFNβ产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。
IFN分子蛋白质工程改造，活性可提高上万倍，同时降低副作用。
6、代谢工程技术平台
Bailey,J.E.（1991）:
“用运重组DNA技术通过对细胞酶的、传递的及调控的功能进行操作而对细胞的活性进行改进”。
Stephanopoulos,G.N.etal（1998）:
“用运重组DNA技术通过对胞内特定生化反应进行修饰或导入新的生化反应而对产品的生成或细胞的性质进行定向改进”。
代谢工程就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞代谢系统以改进细胞性能或提高产物生产能力或收率。
L-天冬酰胺酶：
白血病受选药物，E.coli生产，提高酶活力，体内半衰期短（2分钟）
（1）基因工程技术提高酶活力40余倍；
（2）制备L-天冬酰胺酶－抗体融合蛋白，其半衰期短提高到9小时。
代谢工程可不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，主要包括：
（1）异源蛋白的生产;
（2）扩大底物利用范围;
（3）生产原来不存在的新物质;
（4）对环境有害物质的降解;
（5）提高菌体对环境的适应能力;
（6）阻断或降低副产物的生成;
（7）代谢产品生产速率和生产能力的提高;
（8）植物代谢工程;
（9）动物代谢工程；
（10）人体和组织代谢工程：
人类疾病诊断和基因治疗。
7、生物信息技术（BioIT）平台
生物信息工程学（bioinformatics）可以简单的定义为计算机与信息技术在生命科学中的应用，它是一个年轻和快速发展的领域。
生物信息工程学运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量生物学研究的实验数据中所包含的生物学意义，包括此类数据的采集、存贮、整理、归档、分析与可视化等。
生物芯片（Biochip）:
通过微电子技术在固相基质（如硅片、朔料、玻璃等）构建微型生化分析系统，实现对生物大分子的准确、快速、高通量检测。
产业方面：
相关仪器；
软件；
医学诊断；
环境监测；
反恐等。
市场前景：
目前10－15亿美元，预计2006年50亿美元，2010年可达400亿美元。
8、干细胞（stemcell）技术平台
干细胞可通过分裂维持群体大小，还可近一步分化成为不同的组织细胞。
有全能（如胚胎干细胞）、多能（如神经干细胞）、专能（如角膜干细胞）之分。
组织器官的缺损或功能障碍是健康的主要危害之一，如年增25万白血病、乙肝1.2亿携带者、3.62％的糖尿病患病率、先天缺陷、烧伤、癌症等等。
9、个体医学技术平台
个体医学技术源于中医的个体辨证论治。
HGP的进展发现，人与人的核苷酸不完全相同，人类基因平均有14个可遗传版本；
疾病的易感性与基因有关，约6000种遗传病与基因的变异有关；
个体的药物敏感性不同，任何药物不可能适用于所有不同的个体。
10、反生物恐怖技术平台：
已知可用于生物恐怖的微生物：
25种病毒（如Ebola,90%死亡率）；
13种细菌（如炭疽杆菌、肉毒杆菌、鼠疫菌等）；
4种立克次体；
1种依原体；
2种真菌；
3种原虫。
SARS?
此外，多种基因重组病毒或细菌难以预测。
研发重点：
病原体快速监测技术（生物芯片）、有效的疫苗与药物等。
二、怎样利用谷氨酸棒杆菌提高生产的色氨酸量
答：
提高色氨酸的产量
利用谷氨酸棒杆菌生产色氨酸；
传统方法是通过突变筛选高产菌株；
重组技术应用：
（1）提高关键酶的表达；
（2）找到有关的新酶；
色氨酸生产的限速酶是邻氨基苯甲酸合成酶，在野生型菌种中引入第二拷贝，产量提高约130％；
三、列举寄生虫检测手段及其优缺点
方法优点缺点
显微镜镜检简单、直接灵敏度低、经验
体外培养、接种小鼠可测到活体及毒性、传染性慢而昂贵、样品丢失等
血清抗体简单快速，可自动化操作特异性不高、潜伏状态
DNA杂交及PCR同上，特异性强、可区分种类昂贵、不能区分样品死活、假阳性
四、生物技术药物的基本特性
（1）药理学特性
1）药理活性高
由于生物工程药物产品是细胞中天然存在的高活性分子，作用机制合理，疗效可靠，因此具有药理活性高，用量小的特点。
但药物分子在体内容易降解，半衰期短。
2）毒副作用小
生物工程药物产品主要是蛋白质、核酸等生物大分子，对人体无害，且都是机体的营养物质。
因此相对的毒性较小，副作用低，安全性较高。
3）有生物种属及组织特异性
用于生物进化的差异，不同生物，甚至同一生物的不同个体间的活性分子结构可能会有很大的变化，其中大分子的蛋白（酶）更为明显。
（2）生产制备特性
1）稳定性较差
生物工程药物分子一般具有特定的活性部位，较不稳定。
如温度、压力、pH、重金属等原因都容易引起失活。
2）易污染和腐败
由于生物工程药物分子多为蛋白质和核酸两类高营养物质，极易污染微生物腐败，酶解破坏，失去活性。
生产中对低温、无菌等条件有严格要求。
3）生产系统复杂
利用生物技术修饰的细胞或机体产生的生物大分子，一般在原核（细菌）或真核（酵母、动物细胞）系统中进行。
与普通药物相比，其生产批次间同源性、均一性、有效性及安全性等要求高。
4）活性检验
由于生物技术药物具有特殊的生理功能，除进行普通药物的理化指标检验外，还要进行生物活性检验，如动物模型分析、细胞培养分析等。
五、什么是生物能源？
发展生物能源的益处？
1、生物能源（Bioenergy）:
目前主要指生物质发电（Biopower）和基于生物质生产的各种机动车液体燃料（Biofuels）、沼气等。
生物质能源是唯一可转化为液体燃料的可再生资源；
是一种可显著降低环境中温室气体CO2和酸雨主要成分SO2的能源。
植物基生物质原料生长过程中吸收CO2，其生产和使用不会导致环境CO2总量的净增长。
2、发展生物能源的益处
（1）生物能源是绿色可再生能源,能够保障社会的可持续发展;
（2）对环境友好的清洁能源;
（3）减轻对进口石油的依赖，保障国家能源安全；
（4）促进农产品深加工产业发展。
六、植物生物技术转化的几个方法以及其优缺点
植物基因的遗传转化是指将外源DNA通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞并得到整合和表达的过程。
实现这一转化的途径称之为转化系统。
外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。
目前已经建立了十余种基因转化方法，常见的方法包括：
1、土壤农杆菌介导法：
几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌（A.tumefaciens）感染，而产生根瘤。
其致瘤特性由Ti（tumor－inducing）质粒介导;
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb;
农杆菌介导的转化法的优点：
1）操作简便、2）成本低、3）转化率高，4）广泛应用于双子叶植物的遗传转化
农杆菌介导的转化法的缺点：
单子叶植物受限制；
苏云金杆菌的δ-内毒素
苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。
在细菌中积累的δ-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。
不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。
2、基因枪法（biolistics）也称微粒轰击法（microparticlebombardment）
最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。
1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。
基因枪的组成部分有：
点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。
基因枪转化的基本步骤如下：
DNA微弹的制备
DNA-微弹载体的制备
靶外植体准备
DNA微弹轰击
轰击后外植体的培养
基因枪法的优点：
1）无宿主限制，受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分生组织等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以；
2）可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞；
3）操作简便迅速；
缺点：
1）相对于农杆菌介导的转化率要低得多，
2）而且基因枪转化成本高；
3）嵌合体比率大；
4）遗传稳定性差；
3、电激法（electroporation）：
利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入植物细胞的转化方法。
优点：
操作简便，特别是适用于瞬间表达研究
原生质体培养麻烦，加上电击易造成原生质体损伤，其再生率降低
4、花粉管导入法：
即利用花粉管通道，将外源DNA注入进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞（卵、早期胚细胞），并自然发育成种子。
1）花粉管通道法不仅可以用于外源总DNA的导入，也可以用于基因的导入，
2）有方法简便，
3）基因转化效率高
4）缩短育种年限等优点。
1）只有在开花时期才能应用2）转化植株可能带有少量目的性状基因以外的DNA片断；
3）目的性状转化与否带有很大的机遇性4）转化效率低。
附：
2003年试题及答案（2005届第1、3、6题在2003届中也出现）
一、PHA（聚羟基脂肪酸）的基因工程生产
（1）获得具新颖结构的PHA分子；
已经有大约10个与PHA合成有关的基因被发现；
用重组大肠杆菌可以合成PHA、PHB和共聚物聚羟基丁酸己酸酯（PHBHHx）。
（2）改造PHA组分：
如对链长进行控制；
真养产碱菌（A.eutrophus）4－5个单体的短链；
食油假单胞菌（P.oleovorans）6-14个单体的中长链；
（3）降低PHA的生产成本，提高生产率，与传统石油塑料竞争；
高密度培养重组大肠杆菌的技术使聚羟基丁酸PHA的生产效率得到很大的提高；
通过把细菌合成PHA的基因导入植物；
据推算如果植物中的PHA的含量能达到其他脂类储存物的平均水平，即达到植物细胞干重的20－40wt%，则价格降到每公斤0.5美元左右，完全可与塑料的价格相当；
1、PHA在植物中表达
将PHB基因转到棉花中，使棉花纤维的性能与天然棉纤维有了明显差别；
将PHA基因转到拟南介植物中,植株中的PHA含量提高到12－13wt%，种子中PHA含量也达到了7wt%;
2、PHA应用
PHA的生物相容性和生物降解性使其可以作为体内植入材料包括组织工程材料和药物控制释放载体等。
如可以根据人体组织的性能特点，设计出所需的PHA组织骨架。
农业上包裹肥料或农药的载体，使被包裹的物质在PHA缓慢降解的过程中缓慢释放出来，从而保持长期的肥效或药效，同时减少用药量，延长作用时间，保护耕地的长期可种植性。
二、生物技术药物的提取与纯化的原则
目标药物分离纯化应考虑：
1）抑制相应细胞的酶活性；
2）清除非目标成分，过敏源、热源；
3）优化分离纯化工艺；
4）建立技术检测与质量控制方法；
5）工艺设备验证；
6）小试、中试过程贯彻GMP原则。
一般步骤：
⑴生物组织与细胞的破碎
破碎方法:
磨切法、压力法、反复冻融法、超声波震荡、自溶法、酶解法
⑵提取
破碎后立即提取,根据活性物质的性质，选择提取试剂种类、用量、提取次数、提取时间,注意提取温度、pH、变性剂等；
颗粒性杂质的清除：
离心、过虑
可溶性杂质的清除
常见可溶性杂质的类别
蛋白多肽；
沉淀、吸附、层析、超滤、超速离心等方法；
脂类、脂蛋白；
萃取等；
多酚类：
沉淀、层析等方法；
核酸类：
离子交换层析、酶解等；
内毒素：
脂多糖类，超滤、吸附、离子交换层析、层析等方法；
小分子类：
盐、糖等，透析、层析、超滤
可能出的题目：
一、转基因植物的安全性评价
转基因植物的安全性评价是指对重组DNA导入植物体内所获得的遗传工程体及其产品对人类健康、人类赖以生存的环境、农业生态平衡等方面可能造成的影响进行安全性预测和评价。
对于转基因生物的疑虑主要有两个方面，一是对人体健康是否有害，即食品的安全性；
二是对生态环境是否构成潜在威胁，即环境的安全性。
1、基因植物的食品安全性评价
对于转基因植物的食品安全性评价，世界上多数国际采用经济合作发展组织（OrganizationofEconomicCo-operationandDevelopment,OECD）1993年提出的实质等同性（substantialequivalence）原则。
（1）如果转基因食品与传统食品具的实质等同性，则认为是安全的。
（2）如果转基因食品与传统食品除引入的新性状外具有实质等同性，则需时行严格的安全性状价。
（3）如果转基因食品与传统食品不具有实质等同性，则应从营养性和安全性角度进行全面分析。
在对转基因的食品进行实质等同性评价时，一般应主要考虑以下几个方面：
首先是有无毒性，转基因植物必须确保转入的外源基因或基因产物对人畜无毒。
其次是有无过敏性。
另外还要考虑营养物质、抗营养因子的含量及标记基因的安全性等。
转基因植物及其加工食品的安全性
1）转基因作物安全性争议的几大事件：
1995加拿大“超级杂草”事件：
转基因油菜；
1998年苏格兰“马铃薯”事件：
转基因马铃薯引起老鼠器官发育异常？
1999美国“斑蝶”事件：
《自然》论文，斑蝶食用转Bt玉米花粉后，44％死亡，破坏生态？
2002中国转Bt棉事件：
破坏农田昆虫生态？
2.转基因植物的环境安全性
对转基因植物的环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间去是否会将基因（包括转基因）转移到野生植物中，或是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。
转基因作物的潜在风险
（1）转基因作物可能变为杂草；
（2）转基因作物使野生近缘种变为杂草；
（3）可能产生新的病害；
（4）转基因作物对环境生态的长期破坏；
（5）对非目标生物的伤害等。
3、选择性标记的安全性
大部分植物载体含有kan抗性基因，以便筛选转基因植株。
kan抗性基因，又称为nptII，来自于细菌编码新霉素转移酶II，担忧：
1）食品中的kan抗性基因是否能传给人体肠道中的细菌，产生对抗生素的抗性。
2）kan抗性基因能否传给环境中的其他生物，导致生态系统的破坏；
转基因食品通过人体的消化道与肠道中的细菌接触之前kan抗性基因已经被破坏，转化到细菌的机会也非常少；
然而危险因素并不等于0
去除标记基因：
利用噬菌体P1含有Cre基因，它识别一个34kb的跨越序列，并可以将中间序列切除；
利用这一系统，必须使用两个克隆载体进行转化，其中一个含有目的基因及选择标记基因，选择标记基因两端被Cre靶序列包围；
另一个载体含有Cre基因，转化完成后，Cre基因的表达可以将kan抗性基因从植物中切除；
4、国内外转基因植物的安全性评价概况
欧洲政坛和媒体普遍持怀疑态度；
1999年欧盟7国决定，暂停研发新的转基因食品；
欧洲环保分子经常发生毁坏转基因作物试验田事件；
美国、加拿大的民众73％的消费者接受转基因食品；
美国60％的加工食品中含转基因成分；
2000年美、中、印、巴等科学院发表白皮书支持。
二、转基因植物的应用
有以下几点应用
1、植物病毒抗性
抗病毒植物：
I病毒外壳蛋白基因：
Cp基因可能以下述作用方式使植物获得保护：
（1）当裸露的病毒遗传物质进入植物细胞后，立即被外壳蛋白包装，阻止病毒核酸的翻译与复制。
（2）在Cp水平上阻止病毒脱壳。
TMV外壳蛋白CP的转基因烟草植物，该转基因植物在TMV存在条件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。
马铃薯、番茄、苜蓿、番木瓜等也已成功；
II转表达复制酶亚基反义基因的植物：
将TMV5'
端基因片段（含复制酶亚基因）作为目的基因，成功地构建了其反义基因的转烟草植株。
实验结果表明，病毒RNA的合成抑制了25~50倍。
系统的病毒侵染症状特征消失或大量减少。
此外，卫星RNA、核糖体失活蛋白基因、干扰素也成功的应用于转基因抗病毒植物的培育。
2、细菌及真菌抗性
3、植物的抗逆性
4、植物的性状改良
如：
延迟果实成熟转基因番茄
多聚半乳糖醛酸酶
番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。
运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。
利用反义RNA延迟番茄果实的成熟。
从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。
引入植物后，转录后形成了反义RNA。
降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。
实验的结果通过4个途径分析
1）Southern杂交检测反义基因；
2）利用只能与反义RNA杂交的单链探针，Northern杂交检测反义基因的转录；
3）检测转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照；
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低；
转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但可以存放很长的时间。
这意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。
5、转基因花卉
希望利用基因工程技术，培育出蓝花月季、郁金香和香石竹，以及能够发萤光的奇异花卉等等；
在株型、花色、彩斑、重瓣性、花形等的形成机理取得一定突破的基础上；
已经成功地培育出了重瓣矮牵牛；
株型圆整的观赏马铃薯；
以矮牵牛为模式的植物花色基因工程研究方兴未艾，而且花色基因工程已在包括菊花、香石竹、非洲菊、月季、拟南芥在内的许多物种上获得了成功；
昆虫的荧光素酶基因
植物活细胞基因表达的检测可用昆虫的荧光素酶基因作为报告基因，其工作原理如下：
将昆虫荧光素和ATP表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。
例如，叶子的表面用砂纸磨损然后注入含有昆虫荧光素和ATP的缓冲液中，晾干，将X－光胶片覆盖在叶子上，则表达昆虫荧光素酶的细胞就会使胶片感光与同位素检测方法一样。
6、植物生物反应器
利用转基因植物作为生物反应器，生产异源蛋白质及其它高分子化合物；
（1）异源蛋白药物
植物生长成本较低；
如人的脑腓肽（油菜）、人血清蛋白（马铃薯）、红细胞生成素、干扰素、小鼠单克隆抗体（烟草）等；
（2）食用或工业用油
利用油菜制造肥皂和去垢剂的月桂酸、用于麦淇淋生产的6－十八碳烯酸等；
此外，利用油菜易于生长及产量高的特点，人们还致力于用它生产其它工业用油。
如，作用润滑油及尼龙生产的原料芥酸；
（3）高分子材料
通过转基因植物获得的高分子原材料范围极其广泛。
包括：
可被生物降解的聚羟丁酯塑料（PHB）以及天然棉花与聚酯的混合纤维等.
植物作为生产药用蛋白的生物反应器，为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系，与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，它具有许多潜在的优势：
（1）植物易于操作，成本低廉，推广方便；
（2）植物细胞具有完整的真核细胞表达系统，能准确地进行翻译后加工；
（3）提取纯化过程简单，甚至可以直接食用；
（4）安全性更好，不需要注射，避免血液传染；
（6）来源于植物，无病原污染；
（7）不需要冷藏、方便运输，易于贮存分发等。
三、体细胞胚胎发生
离体培养下体细胞没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，称为体细胞胚或胚状体；
这一定义有以下几方面的界定：
其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；
其二，体细胞胚起源于非合子细胞，非合子胚；
其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径；
四、人工种子的研制和优点
人工种子（artificialseeds）又称合成种子（syntheticseeds）或体细胞种子（somaticseeds）。
任何一种繁殖体，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子；
1、人工种子包埋：
在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀，然后将其逐滴滴入2.0%～2.5%的CaCl2溶液中，经20～30min的离子交换作用，即能形成含有繁殖体并具有一定刚性的小球珠（bead），再用水漂洗20min以终止反应。
此时的人工种子是一种胶囊状结构，将其晾干后可贮存或播种。
2、人工种皮的研制
理想的人工种皮：
具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失；
具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要；
有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作；
无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。
3、人工种子的优点
1）有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；
2）对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子；
3）对不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，可通过人工种子在短期内加大繁殖；
4）可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，还可避免种子携带病原菌的危险；
5）与试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输；
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