医学微生物学与免疫学实验文档格式.docx
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打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光2.
镜的位置，使视野光线充足。
标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓3.
直到油镜头浸入油中接近玻用眼从侧面观察，下降，片为止。
从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊4.
物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。
观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜5.
头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。
如油已干，并立即用另一擦镜可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致纸擦去二甲苯，使镜头脱落。
将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子6.内存放。
3/24
革
兰染色目的：
掌握革兰染色的原理及操作。
材料：
干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液三维肽聚糖结构的主要为细胞壁结构的差异。
原理：
酒精作用使孔径脂质少或无，交联度大，通透性低，外膜含大量脂薄，缩小；
而肽聚糖为二维疏松结构，-质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫碘复合物被酒精溶解而脱色。
1.细菌标本的制作）涂片：
无菌操作。
取一接种环混合细菌悬液，（1的涂片，涂片应薄而均匀。
涂布成直径约1）干燥：
涂片最好在室温中自然干燥。
必要时可2（将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。
）固定：
标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆（3固定的目的放置待冷后染色。
的速度来回通过3次，菌体蛋白质使细菌与玻片黏附较牢固。
是杀死细菌，变性后，提高与染料的亲和力。
4/24
革兰染色2.
钟1）初染：
滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，（1后用自来水缓缓冲洗。
后用自来水缓缓冲11-2滴，
（2）媒染：
滴加碘液洗。
酒精数滴，摆动玻片使酒精与细）脱色：
加95%3（后，立即用自来水缓缓冲洗。
菌充分接触，约20-30s后，自来）复染：
滴加稀释碳酸品红液，30-60s（4水缓缓冲洗。
载片放入消镜检后，用吸水纸吸干后，用油镜观察。
毒缸。
细菌特殊结
构的观察目的：
观察并掌握细菌的形态及特殊结构。
革兰阳性菌、芽孢、荚膜的标本片；
细菌鞭毛、革兰阴性菌染色标本片示教：
革兰阳性菌：
葡萄球菌，紫色革兰阴性菌：
大肠杆菌，红色细菌鞭毛5/24
细菌芽孢细菌荚膜
细菌
的分布目的：
了解细菌在自然界中的分布情况。
普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌材料：
棉拭子、革兰染液。
操作步骤：
1.空气中细菌的检查只，任1
（1）采用沉降法：
取普通琼脂平板培养基24℃培养15分钟，再盖上，37意置一处，启盖约小时，观察有无细菌生长。
）结果判定：
培养基表面可见多种大小、形态不2（一的菌落。
2.皮肤表面细茵检查先在平板底面用记号笔分成两区，:
采用涂抹法
（1）处表面轻轻2作标记，将未消毒的手指在平板的1／用消毒然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，涂抹划线，处进行涂抹，操作完毕，2后的手指在平板另一1／2437置℃培养小时后，取出观察结果。
6/24
结果判定：
培养基表面有几种大小及形态不同的
（2）菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。
3.咽喉部细茵检查用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，
（1）小时后观察结果。
注意观察培养24并划线分离，37并可挑取菌落平板上菌落种类以及是否有溶血现象，口腔微生物检查也可用无菌牙签进行革兰染色检查。
直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。
血平板表面有大小和形态不同的菌落，结果判定：
（2）牙垢涂片镜检可见革兰阳有的菌落周围可见溶血环。
性菌和革兰阴性菌。
紫外线杀
菌实验熟悉紫外线杀菌实验目的：
掌握紫外线杀菌的原理，的操作。
大肠杆菌，琼脂平板，无菌回形状纸.
片，接种环，镊子，紫外灯最适的波长为～240280,原理：
紫外线波长范围为，这与吸收光谱范围相一致。
其杀菌原理是紫外260使的同一条螺旋体上相邻的碱基线易被核蛋白吸收，7/24
导致细菌死从而干拢的复制，形成胸腺嘧啶二聚体，不能紫外线的穿透能力弱，亡或变异。
紫外线特点：
通过普通玻璃、尘埃。
平板密集划线接种。
1.在平板上贴无菌回形纸片。
2.（打开平板盖子）。
照射3034.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。
后观察结果。
℃培养24h5.37
培养基
配制掌握细菌生长的营养成分。
熟悉培养基的配制。
培养基配制的原材料示教：
培养基配制过程。
细菌代谢产物观察和生
长现象熟悉掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。
细菌在各种培养基中的生长现象。
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产气杆菌、大肠杆菌、各种生化管，伤寒杆菌、材料：
变形杆菌等。
对底物的代谢产物也不原理：
不同菌的酶系统不同，从而对细同，用生化的实验方法可将产物检测出来，菌鉴定。
一、细菌代谢产物观察糖发酵实验1.
将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发
进行观察。
培养基中指示18-24h37℃培养酵管内，剂为溴甲酚紫。
培养基由原来的紫色变为如能分解葡萄糖，则产酸，”。
如同时还产生气体，则其黄色，记录符合为“+中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。
培养基由原来的紫色变为黄则产酸，如能分解乳糖，”。
如同时还产生气体，则其中+色，记录符合为“倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。
如培则表明细菌不能分解乳糖不仍为紫色，养基未变色，-”。
能分解乳糖。
记录符合“枸橼酸盐利用实验2.指示剂是澳该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。
℃培分别接种大肠杆菌和产气杆菌，麝香草酚兰。
379/24
.
进行观察养24h若斜面有菌落出现，培养基由原来的绿色变为深兰”，反+色，表明细菌能利用枸橼酸钠，记录符合“”。
之“-靛基质吲哚产生实验3.可分解蛋白胨水培养基中的能产生色氨酸酶的细菌，将大肠杆菌和产气杆菌分别接色氨酸，产生靛基质。
每管各加48h后，种在蛋白胨水培养基中，37℃培养滴，若出现红吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）3-4”；
+色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基质产生阳性“”。
反之为阴性：
“-硫化氢产生实验4.
产半胱氨酸）有的细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的生硫化氢。
。
若培养基中出现黑色℃培养18-24h培养基中，37”，表明产生的硫化氢与培养基沉淀物即为阳性“+（或硫化生成黑色的硫化铅）结合，或铁盐中的铅盐（铁）。
二、细菌生长现象、在液体培养基上生长情况1细菌生长在液面形成菌液体清晰，表面生长：
（1）膜。
如枯草杆菌。
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如或有少量沉淀。
（2）混浊生长：
液体均匀混浊，
大肠埃希菌。
形成细菌生长在管底，沉淀生长：
液体清晰，（3）沉淀。
如链球菌。
2、在固体培养基上的生长情况
（1）菌苔：
在琼脂斜面培养基上长成菌苔。
菌落：
在平板上形成肉眼可见的细菌集团，称为
（2）菌落。
观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、可作为鉴别细菌的透明度、颜色等，边缘是否整齐、依据之一。
（3）色素：
水溶性色素和脂溶性色素。
3、在半固体培养基上的生长情况
在半固体培养基内沿穿由于能运动，有鞭毛的细菌，无鞭毛的使穿刺线变得模糊不清。
刺线弥漫性生长，穿刺线接种生仍没穿刺生长，细菌，因为不能运动，与周围界限清楚。
高压蒸
汽灭菌了解高掌握高压蒸汽灭菌的原理及应用范围，目的：
压蒸汽灭菌的操作。
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高压蒸汽灭菌器。
锅盖原理：
高压蒸气灭菌器是一种坚固密闭的蒸锅，上装有压力计、安全阀及排气孔等。
锅盖密闭旋紧后由锅底加热，因蒸气不能外溢，从而提高了锅内水的沸点和可使锅内压力逐渐增高，放出潜热多，蒸气的温度。
由于高压蒸气的温度较高，凡能耐热和热力穿透能力较强，故其灭菌效能最好。
玻璃器材纱布、生理盐水、耐潮湿的物品如培养基、等都可以应用此法消毒灭菌。
讲解（示教）一个能密闭的耐高压的高压蒸汽灭菌器的主要构件：
双层金属圆筒，蒸汽压力计，安全阀，排气阀等。
不需灭菌物品装入内筒，1.先向外筒注入一定量水，打开以便蒸汽充分回旋。
把筒盖拧紧盖严，宜拥挤，排气阀，开始加热。
水沸腾后，排气阀打开排出气体，待排气孔急促2.
此时筒关闭排气阀，排出蒸汽，表明冷空腔已排尽，内压力逐渐上升。
待压力达到所需值时，适时调节热源，使维持一3.
。
121.3磅，温度℃，维持15-3015定时间。
一般为，自然降压灭菌达到所需时间后，4.关闭热源，（温）12/24
”时，方可开盖取物。
待压力表指针降至“0注意事项：
器内的水量适当。
1.放入的物品不拥挤。
2.排尽冷空气。
3.”时，方可开盖。
04.待压力表指针降至“
凝集实验
（玻片法）熟悉掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，目的：
凝集反应的操作。
多价血清、志贺氏痢疾多OF群材料：
伤寒杆菌A－价血清、生理盐水、未知菌、玻片。
（凝集素）（凝集原）与相应的抗体原理：
颗粒性抗原直接结合，在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现测定细菌的细菌凝集实验。
如红细胞血型的测定，象。
并注明号用蜡笔划为三格，1.取清洁载物玻片一张，F－A码。
于第一格和第二格内各加约30伤寒杆菌第三格内滴加O群多价血清及志贺氏痢疾多价血清，30约生理盐水。
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用接种环挑取待检菌种少许，分别均匀地涂抹于2.
格内的液体中。
接种环每次使用前后均需经32、1、酒精灯火焰烧灼灭菌。
轻轻摇动玻片，数分钟后用肉眼观察结果，出现3.
仍为均匀混悬液者灰白色凝集颗粒者即为阳性反应；
可将玻片放于低倍显为阴性反应。
如结果不够清晰，微镜下观察。
沉淀反应
（双扩散）熟悉掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，目的：
沉淀反应的操作。
干净玻片，玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清、羊抗人将抗原与抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两原理：
在最适当比例处形孔中，抗原与抗体双方自由扩散，成抗原抗体复合物（沉淀线）。
用吸管取干净玻片一片，制板：
用蜡笔分为三格，1.制备琼1.5%加热溶化的食盐琼脂充盈中格，54将－脂板。
打孔：
待琼脂板凝固后，用打孔器打孔。
孔间距2.
14/24
约为5封底：
将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。
3.
加样：
用微量加样器在三孔中加入生理盐水，正4.
注意：
加样μl常人血清和马抗人。
每孔加入约10时勿使液体溢出和孔内出现气泡。
℃温箱中（均扩散：
将琼脂板放入湿盘内，置375.
小时后观察结果。
保持水平位置），于24
（乙肝病毒表面抗原的检
测）目的：
掌握的原理，用途，熟悉其操作过程。
乙肝病毒表面抗原的检测试剂盒、待检血清、微量加样器等。
将酶与抗体（或抗原）用交联剂结合起来，此发生特异性结（或抗体）种酶结合物能与相应的抗原抗原抗体大分子复合物，此时再加-合反应，形成酶最后借助反入酶底物，底物被酶催化生成有色产物，应体系的颜色变化及呈色深浅来推断样品中检测对象的有无或含量。
孔，孔，并设阳性对照0.051．加待检患者血清：
/215/24
孔。
1阴性对照2孔，空白对照孔，空白对照不加，充分混匀，置0.05/2．加－：
37℃30．洗板：
弃去反应板孔内液体，拍干；
用洗涤液注3，弃去孔内洗涤液，拍干，如此10满各孔，静置5－次，拍干。
反复5孔；
再加显色0.05/A，4．加显色剂：
先加显色剂15。
37℃避光0.05/剂B，孔；
充分混匀，置0.05/孔，混匀。
5．终止反应：
每孔加终止液6．测定：
）目测法：
与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅1作出判断）用酶标仪读取各孔值。
2
药敏实验
）
纸片法（目的：
掌握纸片法药敏实验方法，熟悉微生物培养，了解抗生素对细菌的作用机制。
了解含药纸片的制备材料：
大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打6）直径，抗生素纸片。
（孔器在一定的药物在琼脂上扩散，原理：
形成浓度涕度，16/24
则不能抑制浓度过低，浓度下，对细菌抑制或杀死，或杀死。
从而形成一定大小的抑菌圈。
平板上密集划线接种。
1.药片与平板边种含抗生素的纸片于平板上。
贴4-52.。
，药片之间相距至少2缘相距至少1.5测量抑菌圈直径大小，24h℃培养后观察结果。
3.37判断敏感性。
消毒剂对
细菌的影响了解熟悉微生物培养，目的：
掌握含药纸片的制备。
消毒剂对细菌的作用机制。
大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打酒精，金70%直径约6），（（孔器直径6），滤纸纸片星消毒水，紫药水、红药水。
在一定的药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，原理：
1.平板上密集划线接种细菌。
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将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿，在2.
容器边缘沥干，即为含药的滤纸片。
种。
药43.将以上含药滤纸片贴于平板上，每块贴。
1.5，药片之间相距至少2片与平板边缘相距至少测量抑菌圈直径大小，后观察结果。
37℃培养24h4.
判断抑菌效果。
口服药物的微
生物检查熟悉其操作目的：
掌握口服药物的微生物检查指标,过程。
一、细菌总数检测材料：
待检中成药片剂或丸剂，吸管、烧瓶、研钵、普通琼脂培养基、无菌生理盐水、试管、平板。
加入无菌生称取一定量待检药物置于无菌研钵中，1.然后移入烧瓶内加足生理盐制成均浆，理盐水研磨，10：
的均匀悬液。
水，使之浓度成为1的无菌生9药液1加入装有：
用2.1吸管吸取110稀释液。
依次在一排：
1001理盐水的试管内，得到10-410-310-210-1倍递增稀释。
管内作10得到、、、18/24
等不同浓度的稀释液。
无菌1用选择适宜的几个稀释度进行测定3.
9吸管分别吸取所选浓度的各种稀释液加入到直接每个平板中加个平板，每种浓度做3的无菌平板中。
℃的琼脂培养的稀释药液。
将融化并冷却至150入倒入平板中，并立刻转动平板使药液和培养基基1524-48h,37℃培养充分混匀。
冷却后的平板翻转，置并求得每一稀释取出计算每一平板中生长的菌落数，3个平板的菌落均数。
度的30-300选取菌落平均数值在4.细菌总数报告将数得的菌落个之间的平板作为菌落总数测定范围。
均数乘以相应稀释度即得到每克或每毫升监测药品中的细菌总数。
稀释度的选择：
个间，即若只有一个稀释度，菌落均数在30-3001.I）。
乘以稀释倍数报告（见表中例个间，则求30-3002.若两个稀释度，菌落均数都在应报2出两者每克或每毫升总均数之比，若比值小于（见表中例Ⅱ、则报告较多的数值2告其均数，若大于Ⅲ）。
个，取稀释度300若所有稀释度菌落均数多大于3.
最高的菌落均数乘以稀释倍数报告（见表中例Ⅳ）。
19/24
个，取稀释度最304.若所有稀释度菌落均数均少于低的菌落均数乘以稀释倍数报告（见表中例Ⅴ）。
一个30-300个之间，若所有稀释度菌落均数不在5.
时，则个，相邻另一稀释度小于30稀释度大于300个的菌落均数乘以稀释倍数报告（见以接近30-300表中例Ⅵ）。
细菌计数结果及报告方法
比稀释倍数菌落均数报告方式菌落总数值
例
-3-1-210次1010）
（个/克或（个/克或）
-136516420Ⅰ
41016000/1.616400×
1.646Ⅱ2760295
438000/3.8×
1037750
602.2Ⅲ2890271
4×
1027000/2.727100
不可Ⅳ
5130004650计513-
20/24
510510000/5.1×
-11275Ⅴ
210×
270/2.7270
不可Ⅵ3030512-计410×
31000/3.1500
二、霉菌总数的测定材料：
待检中成药片剂或丸剂，吸管、烧瓶、研钵、马丁培养基、无菌生理盐水、试管、平板。
加入无菌生1.称取一定量待检药物置于无菌研钵中，然后移入烧瓶内加足生理盐理盐水研磨，制成均浆，10的均匀悬液。
水，使之浓度成为1：
的无菌生91加入装有药液用1吸管吸取1：
102.
稀释液。
依次在一排1001：
理盐水的试管内，得到10-4、10-2、、10-3倍递增稀释。
管内作10得到10-1等不同浓度的稀释液。
，分别加入无菌平板取适宜稀释度的稀释液各3.1个平板。
3中，每个稀释度各做虎红的℃的内含融化并冷却至将4.15504/3000021/24
马丁培养基倒入平板中，充分混匀、凝固。
计算平板内染72h。
℃培养5.将平板倒置，置25-28因成粉红色的霉菌菌落均数（如有根霉或毛霉生长，应及时取出计数以其能蔓延生长而掩盖了其他菌落，免影响结果）。
真菌的菌落计数时，先点清每个平板上生长的菌6.
判断结果落数，再求出每一个稀释度的菌落平均数。
个范围以内的菌落数乘以相应稀5-50时选取均值在若有两个稀释度的菌作为真菌总数报告。
释倍数后，个稀释度的菌落均数3落均数皆在5-50个以内，或稀释度的选择可参照细菌总数测皆不在此范围内时，30-300定时的稀释度选择规则。
即以细菌菌落均值个作为选择稀释度的5-50个相对应于真菌菌落均值参考标准。
例如两个稀释度的真菌菌落均值都在稀释度选择可参照上面表中的例Ⅱ、5-50个范围内，例Ⅲ。
外用药物的微生物学
检测熟悉其操作过,目的：
掌握外用药物微生物检查指标程。
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一、绿脓杆菌的检测胆盐乳糖增菌培养基和其他培养基、待检药物、材料：
必要的器械物品等。
胆盐乳糖加入100：
10稀释的待检药品液101.取1增增菌培养基或十六烷三甲基溴化胺肉汤培养基中，。
同时在另一管同一培养基（已加入菌培养18-24h，内含约待检药物）中加入标准阳性对照菌液0.1个活菌作为对照实验。
50-100取上述增菌液面上的菌膜转种在十六烷三甲基溴2.
℃培养24-48h37化胺琼脂平板上。
倒置，挑选扁平、表面湿润呈灰白色，周围有明胶液化3.
进行革环及培养基扩散有水溶性蓝绿色色素的菌落，然兰染色镜检和纯培养。
绿脓杆菌应为革兰阴性菌。
后再进行生化反应，进一步证实。
细菌如有氧化酶能将二甲基对苯二4.氧化酶实验实验时用接胺脱氨而氧化成带红颜色的醌类化合物。
种环挑起可疑菌落涂布在滤纸片上，置于无菌平板二甲基对苯二胺盐酸试剂1%内。
在菌苔上添加数滴直至紫红纸片上菌苔变为粉红色，内，液，如在30s色时，即为阳性。
挑起纯培养物转种到绿脓菌绿脓菌素实验5.
23/24
加24h,素测定用的培养基（培养基）上，37℃培养待氯仿变使得色素溶解于氯仿内，3-5氯仿摇匀，入）11N（为蓝绿色后吸到另一试管内，在该试管内加入振摇后静置片刻，如果盐酸液变为粉红色为1,盐酸再测阳性反应。
如不出现，可延长培养时间，2-3d试。
二、金黄色葡萄球菌检测亚碲酸钠盐培养材料：
待检药品及必要的器械物品，基和高盐琼脂培养基。
瓶含2稀释液）各10接种在取待检药品（1.1：
10进行24h37℃培养有100亚碲酸钠盐培养基上，置个瓶同时加入含菌量为500-1000增菌培养。
其中10.1作为阳性对照。
的标准金葡菌液℃培养372.取增菌培养物转种在高盐培养基，。
24-48h挑起平板上墨黑色的可疑菌落，进行纯培养后做3.
染色，镜检及生化反应。
用接种环挑起菌苔到甘露甘露糖发酵实验4.
℃培养后观察有无产酸产气。
37醇发酵管内，
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