植物超氧化物歧化酶的制备工艺研究Word格式文档下载.docx

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　　Keywords：

Superoxidedismutase（SOD）；

Extractiontechnology；

ActivityofSOD

　　超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD），作为一种专一清除生物体内超氧阴离子自由基（O2-·

）的酶，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少超氧阴离子自由基对生物体的毒害。

目前，人们已从动物、植物和微生物体内分离得到，并且通过多种方法应用到实际中［1］，如应用到医药方面、食品、农业、化妆品及人和动植物许多疾病的监测方面等。

　　植物超氧化物歧化酶的制备工艺，其主要目的是纯化植物中的SOD，最大限度地清除杂蛋白，因此，常用的方法主要有热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等［2］。

而本文主要探究超氧化物歧化酶的制备工艺，比较几种常用工艺，热变性法和等电点沉淀法简单，不需加其他试剂，但不能大幅度提高SOD的比活；

盐析法有利于保持蛋白质的生理活性，但分辨率低［3］；

离子交换层析主要用于高纯度的SOD精品的制备，处理量小。

本研究将几种简单工艺相结合，扬长避短，找出一套既简便又能有效提高SOD纯化倍数的方法。

　　1材料与方法1材料与试剂

　　黄瓜；

氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、甲硫氨酸、二乙基氨基乙基纤维素（DEAE）、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（国药集团化学试剂有限公司）、甲叉双丙烯酰胺（中国医药集团上海化学试剂公司）等化学试剂均为分析纯；

标准蛋白采用上海生物化学试剂公司产的牛血清白蛋白；

考马斯亮蓝G-250（上海化学试剂分装厂）。

2仪器

　　722光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；

DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；

电热恒温水浴锅JK-S26型（上海华联医疗器械有限公司）；

高速冷冻离心机D-37520（OsterodeKendroLaboratoryProducts）；

LGJ-10冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂研制，北京松源滑行科技发展有限公司制造）；

HD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂）；

DHL-A电脑恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；

DBS-100电脑全自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）。

3方法

　　将黄瓜用清水洗净，称取100g，以∶1比例［3］加入，mol/L的磷酸盐缓冲液150ml，先加75ml磷酸盐缓冲液和少许石英砂，用高速组织捣碎机充分搅碎，在12000r/min，4℃离心40min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入75ml磷酸盐缓冲液，冰浴充分研磨，并12000r/min，4℃下离心40min，弃去沉淀，合并两次上清液，制得粗酶液。

将粗酶液静置于55℃恒温水浴锅中25min，进行热变性，使杂蛋白变性沉淀下来，再在4℃下12000r/min离心20min，弃去沉淀，保留上清液。

用mol/L盐酸调节上清液，使其pH达到，在4℃下12000r/min离心20min，收集上清液。

在上清液中加入固体硫酸铵粉末，使溶液达到45%的饱和度后，用玻璃棒搅拌30min，然后冷藏静置2h，再在4℃，12000r/min离心40min，去除沉淀，取上清液；

再加入固体硫酸铵粉末到90%饱和度，搅拌30min，冷藏过夜，再在4℃，12000r/min离心60min，取沉淀，溶解于，mol/L的磷酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，待上柱。

　　预先处理DEAE-纤维素，装柱，将待上柱的酶液加入层析柱中，用，mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度控制在3ml/min，以每管3ml收集洗脱物，收集70管，将收集SOD活性峰的部分合并，测定蛋白峰处各管的酶活力（U）及蛋白质含量（mg）。

将收集的酶液，4℃透析，再置于－70℃冰箱中，冷冻过夜，用冷冻干燥机将酶液制成干粉，即为成品。

4SOD的鉴定本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及SOD酶活性染色来鉴定纯化物确为SOD［4］。

5超氧化物歧化酶（SOD）活力测定用NBT光还原法来测定超氧化物歧化酶的活性，根据光照时体系中产生氧自由基使NBT还原成蓝色甲簪（在560nm处有一吸收峰），而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。

酶活性单位采用抑制NBT光还原50%为一个酶活性单位表示［5］。

6蛋白质含量测定以考马斯亮蓝G250在595nm波长下制作标准曲线，再进行样品液中蛋白质含量测定，根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，重复3次取平均值，通过计算求出样品中蛋白质含量（mg）。

　　2结果

　　沉淀法分离SOD本实验通过热变性沉淀法、等电点沉淀法从黄瓜中分离SOD，在此过程中，热变性温度、pH的选择均对分离提取SOD存在影响。

　　热变性温度对提取SOD的影响SOD是一种热稳定性很好的酶。

当温度低于80℃时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般杂蛋白却在高于55℃时就易变性沉淀。

因此选择不同温度及时间对粗酶液进行热击。

酶活性结果见表1。

表1热变性温度和时间对SOD活性（U）的影响

表1结果表明，在55℃下热击25min时，酶活性最大，因此确定选择在此温度、时间进行处理；

则SOD粗酶液在热击前后结果见表2。

表2热变性前后处理结果比较

从表2可发现，热变性前后，总蛋白含量从4mg下降到mg，而SOD酶活却没有明显变化，说明粗提液中部分杂蛋白被除去，而单用此方法提纯SOD，其纯化倍数为倍。

　　不同pH对分离SOD的影响在pH值～范围内，调节SOD粗酶液的pH值，研究不同pH对SOD分离的影响。

结果如图1。

从图1可知，用等电点沉淀法处理粗酶液，在pH=时，总蛋白含量最低为mg，SOD总活力最高为U，比活为U·

mg-1，纯化倍数为倍；

pH大于后，总蛋白含量逐渐恢复，说明大部分蛋白在pH为时被去除，此时纯化效果最佳。

　　硫酸铵分级沉淀法浓缩SOD对SOD粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，首先选择最佳的硫酸铵饱和度（30%～55%）清除杂蛋白，12000r/min离心40min，弃去沉淀，测出上清液中总蛋白质含量及总SOD酶活性（见表3），再选择一定浓度的硫酸铵饱和溶液（60%～90%），使SOD呈盐析状态，沉淀出来，测定其总蛋白质含量及总酶活。

结果见表4。

表3第1步硫酸铵沉淀结果

表3～4结果表明，用硫酸铵分级沉淀法处理粗酶液，在饱和度为45%和饱和度90%时，SOD比活最高，分别为6U·

mg-1和U·

mg-1，说明分离效果最明显，因此若用此方法提纯，其纯化倍数分别为和。

　　综合法提纯SOD按本实验的方法，将热变性法、等电点沉淀法、硫酸铵分级沉淀法相结合处理，再经DEAE-纤维素离子交换柱（cm×

25cm）层析纯化，用，/L的磷酸缓冲液洗脱，流速在3ml/min，每管收集3ml洗脱液，洗脱曲线和酶活测定结果如图2。

洗脱曲线上出现2个蛋白峰：

Ⅰ，Ⅱ，经活力测定后发现酶活性峰与峰Ⅱ基本重合，所以峰Ⅰ为杂蛋白，合并SOD活性部分，4℃透析，再置于－70℃冰箱中，冷冻过夜，冷冻干燥浓缩后，用于电泳鉴定。

表4第2步硫酸铵沉淀结果

此综合法的提纯效果与单一方法提纯相比，SOD酶比活力明显有大幅度的提高。

结果见表5。

表5综合法分离提纯黄瓜超氧化物歧化酶的结果

从表5中可以看出，黄瓜SOD分离纯化前的比活为U·

mg-1，经最终纯化后的比活为U·

mg-1，纯化倍数为，回收率为%。

　　电泳鉴定SOD将浓缩干燥后的成品，溶解于，mol/L的磷酸缓冲液中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳6h，用SOD活性染色见图3。

　　由图3可见，提纯后的物质经电泳处理，再进行SOD活性染色后，出现一条透明条带。

因此，可以确定，该提纯物质确为超氧化物歧化酶。

　　3讨论

　　实验误差实验过程中，对SOD各步的酶活力和总蛋白含量进行计算，其比活和纯化倍数较低，可能与操作过程中样品放置时间的长短和试材的质量有关；

另外，在运用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定SOD时，发现最终的电泳条带只有一条，可能是由于提纯物中还存在一定量的杂蛋白；

也可能与点样中SOD含量有关，据有关文献显示，通过离子交换后，总蛋白含量一般在4～10mg［6，7］,而本实验只是从100g黄瓜中提取，其最终总蛋白含量为2mg，因此其余两条带不能清晰显现。

　　单一方法与综合法的比较从结果分析可知，若用热变性法处理粗酶液，在55℃下热击25min，部分杂蛋白被去除，比活从9U·

mg-1上升至0U·

mg-1，此工艺的纯化倍数为，回收率为%；

若用等电点沉淀法，选择pH=时处理粗酶液，则提纯后总蛋白含量为mg，酶总活力为U，比活为9U·

mg-1，纯化倍数为，回收率为%；

若只采用45%和90%的饱和硫酸铵处理粗酶液时，酶的比活则分别为6U·

mg-1和4U·

mg-1，纯化倍数分别为和，回收率分别为%和%。

而用综合法提纯SOD，提纯后总蛋白含量为2mg，酶总活力为7U，比活为1U·

因此可以看出，用单一方法提纯粗酶液，其比活和纯化倍数均不是很高，说明单一方法分离提纯SOD，不能有效提高其纯度。

　　在实际中的应用从整个制备工艺提纯后的回收率中，我们发现提纯步骤越多，最终获得的蛋白含量越少，也就是说，在每步提纯之后，杂蛋白被逐渐去除了，达到了预期的目的。

但从另一方面看，若将此方法用于工业化生产，虽说最终SOD酶比活力能达到1U·

mg-1，可回收率却只有%，那么在投放市场后，企业的投入与产出就不能有效地达到平衡。

所以，若作为企业生产，则最好是酶的比活要高，且回收率也要高，要在两者之间寻找一个平衡点。

。

由图4可知，在第4、第5步时，即在硫酸铵分级沉淀后，比活与回收率乘积最高，此时比活约为6U·

mg-1，回收率约为%，最适宜企业生产，最可能得到可观收益。

　　综合考虑，若要获取高比活的精制品，则本实验工艺可以满足需求；

若要符合实际生产投放市场，则可适当减少提出步骤，提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀为止。

通过将黄瓜粗酶液经热变性沉淀、等电点沉淀处理后，再经45%，90%硫酸铵分级沉淀和DEAE-纤维素离子交换层析，四步纯化后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳及SOD活性染色进行鉴定，确定提取得到的为黄瓜SOD酶。

实验结果表明，黄瓜SOD酶的比活为1U·

mg-1，回收率为%，提纯倍数为倍，工艺所用时间约为48h；

很明显，提纯效果比单一使用某一方法要好。

因此若要获取高比活的精制品，则本工艺可以满足需求；

若要符合实际生产投放市场，则可适当减少提纯步骤，提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀为止。

【参考文献】

　　［1］丁琳，姜红，王丹焱，等.榆树叶超氧化物歧化酶的纯化及性质研究［J］.沈阳化工学院学报，2005,19（4）:

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　　［2］金绍黑.植物超氧化物歧化酶的提取、修饰制备工艺及其应用研究［J］.成都航空职业技术学院学报，2005,21

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　　［3］邓旭，李清彪，孙道华，等.从大蒜细胞中分离纯化出超氧化物歧化酶［J］.食品科学,2001,22（9）:

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　　［4］姚澍晖.蕨菜SOD同工酶分析［J］.特产研究,2004,3：

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　　［5］朱广廉，钟诲文，张爱琴.植物生理学实验［M］.北京：

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