生物工艺学 培养基及制备Word文件下载.docx
《生物工艺学 培养基及制备Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物工艺学 培养基及制备Word文件下载.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
微生物所需的营养物质之间应有适当的比例，培养基中的碳氮的比例（C/N）的积累；
氮源不足，则微生物菌体生长过于缓慢。
碳源供应不足时，容易引起微生物菌体的衰老和自溶。
不同的微生物菌种、不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的。
3．渗透压
营养物质的浓度太低，不仅不能满足微生物生长对营养物质的需求，而且也不利于提高发酵产物的产量，浓度过高时，培养基溶液的渗透压太大，会抑制微生物的生长。
培养基中各种离子的比例需求要平衡。
在发酵生产过程中，在不影响微生物的生理特性和代谢转化率的情况下，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产物产量，并尽可能选育高渗透压的生产菌株。
4．pH值
一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。
当培养基配制好后，若pH值不合适，必须加以调节。
同时加入缓冲剂，以调节培养液的pH值。
5．氧化还原电位
对于厌氧菌，由于氧的存在对其有毒害作用，因而往往在培养基中加入还原剂以降低氧化还原电位。
除应注意以上几条原则外，还要考虑到营养成分的加入顺序，为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失，加入的顺序一般为先加入缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质。
4、培养基成分配比的选择
1.菌体的同化能力2.代谢物的阻碍与诱导作用3.合适的碳氮比
由于碳既做碳架又作能源，所以用量要比氮多。
从元素分析来看，酵母细胞中碳氮比约为100:
20，霉菌约为100:
10。
一般发酵工业中碳氮比约为100:
（0.2~2.0），但在氨基酸发酵中，碳氮比就相对高一些。
如谷氨酸发酵的C:
N=100:
（15~21）。
培养基各成分用量的多少，大部分是根据经验而来。
但有些主要代谢产物因为它们的代谢途径较清楚，所以根据物料平衡计算来加以确定。
如酒精发酵
100kg淀粉理论上可以产酒精
（kg）
第二节工业发酵培养基
在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，使之尽可能地满足下列条件：
①消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率；
②能产生最高的产品或菌体的浓度；
③能得到产物的最大速率；
④副产品的得率最小；
⑤价廉并具有稳定的质量；
⑥来源丰富且供应充足；
⑦通气和搅拌、提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易。
用甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、谷物淀粉等作为碳源，用铵盐、尿素、硝酸盐、玉米浆及发酵的残余物作为氮源。
除了能满足生长和产品形成的要求外，培养基也会影响到pH值的变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态。
在培养基中，有时也需要添加前体物质或代谢的抑制剂，有时需加促进剂，以促进产物的形成。
一、工业上常用的碳源
普遍以碳水化合物作为碳源。
玉米淀粉，马铃薯、木薯淀粉。
淀粉可用酸法或酶法水解产生葡萄糖，满足生产使用。
表3-2工业上常用的碳源及来源
碳源
来源
葡萄糖
乳糖
淀粉
蔗糖
纯葡萄糖、水解淀粉
纯乳糖、乳清粉
大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、大豆粉等
甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等
大麦经发芽制成麦芽，除了淀粉外，麦芽还含有许多糖分。
麦芽是啤酒生产的主要原料。
蔗糖一般来自甘蔗或甜菜，在发酵培养基中常用的甜菜或甘蔗糖蜜是在糖精制作过程中留下的残液。
用于生产疫苗的培养基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。
酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质在发酵过程中作为碳源，虽然它们的价格比相等数量的粗碳水化合物要昂贵很多，但由于纯度较高，便于发酵结束后产物的回收和精制。
甲烷、甲醇和烷径已经用于微生物菌体的生产，例如将甲醇作为底物生产单细胞蛋白，用烷径进行有机酸、维生素等的生产。
二、工业上常用的氮源
工业生产上所用的微生物都能利用无机或有机氮源，无机氮源包括氨水、铵盐或硝酸盐等；
有机氮源包括玉米浆（cornsteepliquor,CSL）、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。
其功能是构成菌体成分，作为酶的组成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。
表3-4工业上常用的氮源及含氮量（质量分数）/%
氮源
含氮量
大麦
甜菜糖蜜
甘蔗糖蜜
玉米浆
1.5~2.0
4.5
花生粉
燕麦粉
大豆粉
乳清粉
8.0
三、无机盐
无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。
其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基渗透压、调节pH值和氧化还原电位等。
微生物对无机盐的需要量很少。
但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。
1．磷酸盐
磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。
腺二磷（ADP）、腺三磷（ATP）是重要的能量传递者，参与一系列的代谢反应。
磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。
微生物对磷的需要量一般为0.005~0.01mol/L。
工业生产上常用K3PO4·
3H2O、K3PO4和Na2HPO4·
12H2O、Na2HPO4·
2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。
K3PO4·
3H2O含磷13.55%，当培养基中配用1~1.5g/L时，磷浓度为0.0044~0.0066mol/L。
2．硫酸镁
镁是某些细菌的叶绿素的组成分。
是许多重要的酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂。
革兰阳性菌对Mg2+的最低要求量是25mg/L。
革兰阴性菌为4~5mg/L。
硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成分。
硫是构成一些酶的活性基。
培养基中的硫已在硫酸镁中供给。
3．钾盐
钾是许多酶的激活剂。
菌体生长需钾量约为0.1g/L，谷氨酸生成需钾量为0.2~1.0g/L。
钾对谷氨酸发酵有影响，钾盐少长菌体，钾盐足够产谷氨酸。
4．微量元素
微生物需要量十分微小，但又是不可缺少的，例如锰是某些酶的激活剂，铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的成分，又是若干酶的激活剂。
一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。
汞和铜离子，具有明显的毒性，必须避免有害离子加入培养基中。
四、生长因子
通常指微生物生长不可缺少的而且需要量很小微，但微生物自身不能合成或合成不足以满足机体生长需要的有机化合物。
生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。
1．生物素
生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。
大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。
一般为5μg/L左右。
2．维生素B1（硫胺素）
维生素B1对某些谷氨酸菌种的发酵有促进作用。
3．提供生长因子的农副产品原料
（1）玉米浆玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物，也是玉米淀粉生产的副产品。
一般用量为0.4%~0.8%。
玉米浆主要用作氮源，但它含有乳酸、少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，因此常用作为提供生长因子的物质。
（2）麸皮水解液可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。
用量一般为1%（干麸皮计）左右。
（3）糖蜜甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米浆。
但氨基酸等有机氮含量较低。
甘蔗糖蜜用量为0.1%~0.4%。
（4）酵母可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。
五、前体物质和促进剂
为了进一步大幅度提高发酵产率，还需要添加某些特殊功用的物质。
这些物质加入到培养基中有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长。
例如某些氨基酸、抗生素、核苷酸和酶制剂的发酵需要添加前体物质、促进剂、抑制剂及中间补料等。
1．前体物质
某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。
在一定条件下前体物质可控制生产菌的合成方向和增加抗生素的产量。
表3-7氨基酸发酵的前体物质
氨基酸
菌株
前体物质
产率/%
丝氨酸
色氨酸
蛋氨酸
异亮氨酸
苏氨酸
嗜甘油棒状杆菌
异常汉逊酵母
麦角菌
脱氮极毛杆菌
粘质赛杆菌
阿氏棒状杆菌（Corynamagasahi）
谷氨酸小球菌
甘氨酸
氨茴酸
吲哚
2-羟基4-甲基硫代丁酸
-氨基丁酸
D-苏氨酸
高丝氨酸
1.6
0.8
1.3
1.1
1.5
2.0
但要注意这些前体加入过多对菌体会产生毒性。
表3-8抗生素发酵常用的前体物质
抗生素
青霉素G
青霉素O
青霉素V
链霉素
苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如乙基酰胺等
烯丙基-硫基乙酸
苯氧乙酸
肌醇、精氨酸、甲硫氨酸
金霉素
溴四环素
红霉素
灰黄霉素
放线菌素C3
氯化物
溴化物
丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐
肌氨酸
前体物质的利用往往与菌种的特性和菌龄有关。
当前体物质是合成过程中的限制因素时，前体物质加入量越多，抗生素产量就越高。
但前体物质的浓度越大，利用率越低。
故一次加入量不宜过大。
一般采取间隙分批添加或连续滴加的方法加入。
2．发酵过程中的促进剂和抑制剂
在发酵培养基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或刺激剂。
诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。
诱导物，一般的诱导物是相应酶的作用底物或一些底物类似物，“启动”微生物内的产酶机构。
促进剂可大大地增加某些微生物酶的产量。
促进剂有各种表面活性剂（洗净剂、吐温80、植酸等）、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。
0.1%LS洗净剂，蛋白酶0.02%~1%的植酸盐的产酶量。
葡萄糖氧化酶（EDTA）大豆油抽提物，蛋白酶、脂肪酶，促进剂能促进产量增加的原因主要是改进了细胞的渗透性，同时增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。
在不同的情况下，不同的促进剂所起的作用也各不相同。
生长因素的作用推迟菌体的自溶，有的是抑制了某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；
降低了生产菌的呼吸，改善通气效果，与抗生素形成复盐。
促进剂的专一性较强，往往不能相互套用。
第三节淀粉水解糖的制备
大多数的微生物都不能直接利用淀粉，在氨基酸、抗生素、有机酸、有机溶剂等的生产中，都要求将淀粉进行糖化，制成淀粉水解糖使用。
将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。
在淀粉水解糖液中，葡萄糖、麦芽糖和蛋白质、脂肪分解产物在发酵中易被各种菌利用；
而一些低聚糖类、复合糖等杂质则不能被利用。
工业原料的水解糖液，必须具备以下条件：
①糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖浓度的要求。
②糖液洁净，是杏黄色或黄绿色，有一定的透光度。
③糖液中不含糊精。
④糖液不能变质。
淀粉水解糖的意义：
很多微生物都不能直接利用淀粉，因为它们不含淀粉酶和糖化酶，因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖，才能供发酵使用。
淀粉水解：
淀粉—糊精—低聚糖—麦芽糖—葡萄糖
糖化过程：
淀粉吸水溶胀—糊化—糖化
一、淀粉水解糖的制备方法：
酸解法、酸酸法、酸酶法、双酶法
淀粉水解糖的原料很多，主要有薯类、玉米、小麦、大米等含淀粉原料。
水解淀粉为葡萄糖的方法有下列三种。
1．酸解法
它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。
具有生产方便、设备要求简单、水解时间短、设备生产能力大等优点。
要求有耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备。
尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。
淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。
颗粒大，易造成水解不透彻；
淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。
2．酶解法
是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。
利用α-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。
利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解转化为葡萄糖，这个过程在生产中称为糖化。
优点如下：
①酶解反应条件较温和。
不需耐高温、高压、耐酸的设备。
②微生物酶作用的专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率（出糖率）高。
③可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。
④用酶解法制得的糖液颜色浅，较纯净，无异味，质量高，有利于糖液的充分利用。
但酶解反应时间较长（48h），需要的设备较多，需要具有专门培养酶的条件。
3．酸酶结合法
酸酶结合水解法是集中酸法和酶解法制糖的优点而采用的结合生产工艺。
（1）酸酶法是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。
此法的优点是酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。
酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高。
DE值表示淀粉水解的程度，指的是葡萄糖（所测的还原糖都以葡萄糖计算）占干物质的百分比。
（2）酶酸法将淀粉乳先用α-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。
可采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法要高，生产易控制，时间短，而且酸水解时pH值可稍高些，以减轻淀粉水解副反应的发生。
从水解糖液的质量和降低糖耗、提高原料利用率方面来考虑，酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。
时间来看，酸法最短，酶解法最长。
二、淀粉酸水解原理
1．淀粉水解过程中的变化
（C6H10O5）n→（C6H10O5）s→C12H22O11→C6H12O6
淀粉各种糊精麦芽糖葡萄糖
2．淀粉水解反应动力学
于是水解的速率只决定于淀粉的浓度，反应则属于单分子反应的一级化学反应类型。
其反应速率常数k可由下式推算
式中c0——水解开始的浓度；
ct——经过t时间后反应的浓度；
（c0–ct）——经过t时间后，所剩下的未起反应的浓度；
t——时间。
k愈高，则反应速度愈快。
水解速度等于反应速率常数k与浓度（c0–ct）的乘积。
式中a——催化剂的活性常数
cN——酸性物质的摩尔浓度（当量浓度）
——多糖的水解性常数
λ——温度对水解速率影响的常数
淀粉水解所用的催化剂的种类、浓度、反应温度均对水解反应速度有很大的影响。
3．葡萄糖的复合反应
在淀粉的酸水解过程中，水解生成的葡萄糖受到酸和热的催化影响，能通过糖苷键相聚合，失掉水分，生成二糖、三糖和其他低聚糖，这种反应称为复合反应。
复合反应相聚合，并不是经过a-1，4键聚合成麦芽糖，而是经过a-1，6键聚合成异麦芽糖和经过β-1，6键聚合成龙胆二糖。
复合反应是有害的，它降低葡萄糖的收率，而且水解液中多数复合糖并不能被微生物利用。
4．葡萄糖的分解反应
葡萄糖受到酸和热的影响发生分解反应，生成5’-羟甲基糠醛。
5’-羟甲基糠醛是产生色素的根源，有色物质的存在，将增加糖化液精制的困难。
三、淀粉酸水解工艺
1．淀粉酸水解的工艺流程
淀粉
原料水→调浆→糖化→冷却→中和、脱色→过滤除杂→糖液
盐酸
2．淀粉酸水解条件的控制及对糖液质量的影响
（1）淀粉乳浓度的选择淀粉乳的浓度越低，水解液的葡萄糖值越高，色泽越淡。
（2）酸的种类和用量许多酸对淀粉的水解反应均有催化作用，但工业上普遍使用的是催化效率较高的盐酸、硫酸及草酸。
一般用盐酸量占干淀粉的0.6%~0.7%，pH值调至1.5左右。
（3）糖化的压力和时间淀粉水解是用蒸汽直接进行加热的，温度与压力为相同的指标，温度随压力升高而升高。
压力与水解反应速率成正比，压力升高，水解反应速度加快。
为要加快水解速度，可采用增大水解反应压力的方法。
当糖液的葡萄糖值达到最高点后既不再上升，相反会随着糖化时间的延长而稍有下降。
如果不及时放料，势必事倍功半。
图3-1酸糖化曲线
3．糖化设备结构对糖液质量的影响
糖化锅的容量一般不宜过大。
不宜锅体太高，不宜锅体太矮。
糖化锅径高比1:
1.5左右。
糖化锅的附属管道应保证进出料迅速，物料受热均匀，有利于升压，有利于消灭死角，尽量缩短加料、放料、升温、升压等辅助时间。
4．水解糖液的中和脱色除杂
（1）中和需经冷却才能进行中和。
调节pH值，使糖液中胶体物质析出，便于过滤除去。
生产中使用的中和剂有纯碱和烧碱。
纯碱（Na2CO3）温和，糖液质量好，但产生的泡沫多，使用烧碱，浓度过高易造成局部过碱，葡萄糖焦化而产生焦糖。
保持pH值在4.6~5.0之间。
中和温度为60~70℃。
（2）脱色、除杂方法有活性炭吸附法、离子交换法、新型磺化煤脱色。
a.活性炭表面积大，有无数微小的孔隙，它可将杂质、尘埃、色素吸附掉；
同时，活性炭也有过滤作用。
活性炭吸附工艺简单，脱色效果好，操作容易。
一般活性炭用量相当干淀粉量的0.6%~0.8%。
脱色温度一般为65℃。
b.离子交换树脂，具有选择性强，脱色效果较好，便于管道化、连续化及自动化操作，减轻劳动强度的优点。
c.新型磺化煤不同于一般的磺化煤，它具有粒度细（40~120目）、脱色力强的特点。
这种磺化煤尚可直接用于淀粉糖化。
在淀粉加酸糖化时，加入淀粉量1.8%的磺化煤粉一起糖化。
滤液透光率达97%~98%。
（3）压滤压滤温度不宜过高，蛋白质等胶体物质沉淀不完全。
而采用低温过滤，由于糖液黏度增大，又会发生过滤困难。
一般采用60~70℃温度压滤为适宜。
四、双酶水解法制糖
酶法制糖以作用专一性的酶制剂作为催化剂将淀粉转化为糖的工艺。
反应条件温和、复合和分解反应减少，不仅可以提高淀粉的转化率及糖液的浓度，而且还可大幅度地改善糖液的质量。
主要包括液化和糖化两个步骤。
双酶法制糖的工艺流程：
淀粉乳—一次液化—二次液化—糖化—一次脱色—一次过滤—二次脱色—二次过滤—低糖—阳离子—交换柱—三次浓缩蒸发—高糖
（1）液化
液化原因：
淀粉晶体结构对酶作用的抵抗力很强，故需先破坏其晶体结构。
1．淀粉酶的水解作用
淀粉双酶水解法包括液化和糖化两个步骤，均是在酶的作用下完成的。
淀粉的液化是在a-淀粉酶的作用下完成的。
水解中间地段的a-1，4键，断裂发生在C1—O之间。
直链淀粉分子水解产物为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。
枝链淀粉还有异麦芽糖及含有a-1，6糖苷键的低聚糖。
2．淀粉液化的条件及液化程度的控制
（1）淀粉的糊化与老化
淀粉的老化实际上是分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。
淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，必须采用相应的措施控制糊化淀粉的老化。
（2）液化的方法与选择
液化的分类方法很多，分为酸法、酸酶法、酶法，间歇式、半连续式和连续式，管式、罐式、喷射式。
糖液，其黏度的高低会直接影响或决定后道发酵、提取工艺的难易，因此这种糖液的过滤速度一定要求特别快。
通常选用一次加酶或两次加酶的蒸汽喷射液化法较为合适。
3．蒸汽喷射液化工艺及条件
（1）工艺流程
调浆→配料→一次喷射液化→液化保温→二次喷射→高温维持→二次液化
95℃~97℃145℃95℃~97℃
酶解灭酶酶解
→冷却→（糖化）
特点：
利用喷色器将蒸汽喷入淀粉乳的薄膜，在短时间内通过喷色器快速升温至145℃完成糊化、液化，使形成的不溶性淀粉颗粒在高温下分散，从而使所得的液化液既透明又易于过滤，淀粉的出糖率也高，同时采用真空闪急冷却，提高了液化液的第浓度。
（2）淀粉液化条件
每种酶都有最适的作用温度和pH值范围，而且pH和温度是互相依赖的，一定温度下有较适宜的pH值。
图3-3a-淀粉酶活力与pH值的关系图3-4a-淀粉酶活力与温度的关系
酶活力的稳定性还与保护剂有关，一般控制钙离子浓度0.01mol/L。
钠离子
为了加速淀粉液化速度，多采用较高温度液化，85~90℃或者更高，但是温度升高时，酶活力损失加快。
（3）液化程度控制
液化程度太低，液化液的黏度就大，难于操作。
淀粉易老化，不利于糖化，过滤性相对较差。
液化程度也不能太高，不利于糖化酶与液化淀粉生成络合结构，使糖化液的最终DE值偏低。
底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。
控制淀粉水解程度在葡萄糖值为10~20之间为好（即此时保持较多量的糊精及低聚糖，较少量的葡萄糖）。
为避免液化酶对糖化酶的影响，一般液化结束，升温到100℃保持10min即可完成，然后降低温度。
（二）糖化
1．糖化酶的水解作用
糖化酶对底物的作用是从非还原性末端开始，属于外酶，产生α葡萄糖。
糖化酶对α-1，4和α-1，6糖苷键都能进行水解。
糖化酶制剂用量决定于酶活力高低。
酶活力
升级会员 