脑心通联合双联抗血小板药物与标准剂量氯吡格雷治疗CYP2C19基因变异PCI术后患者对照研究全文Word文档格式.docx

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中医治疗是将病人作为一个整体，不仅专注于单一疾病，脑心同治正是基于中医这个理论。

在一项小规模研究中，使用一种圣约翰草（St.John´

swort），可增强氯吡格雷不敏感的志愿者和稳定性冠心病的患者的氯吡格雷抗血小板作用。

我们曾经报道过步长脑心通胶囊（NXT）与双联抗血小板药物联用，可抑制大鼠血小板聚集，平衡促炎和抗炎因子、ET-1和内皮一氧化氮合酶（eNOS）并且减少冠脉微栓塞的形成。

这种治疗方案还能减少微栓塞大鼠模型建立时的术中出血风险。

人体试验中，氯吡格雷联合NXT可增强携带CYP2C19*2基因的气虚血瘀志愿者的抗血小板效果。

然而，NXT联合双联抗栓治疗是否能够改善CYP2C19*2基因型患者PCI术后的临床预后仍不明确。

本研究的目的是通过前瞻性随机对照实验比较双联抗栓以及氯吡格雷1.6g一天三次联合双联抗栓对CYP2C19*2基因型PCI术后患者的血小板抑制率和主要心血管事件（MACEs）的影响。

研究对象

2010年7月-2011年7月在我院心内科住院择期行PCI术的冠心病患者。

入选标准：

年龄≥45岁；

冠脉造影确诊为冠心病，PCI成功患者；

基因分型检测至少携带一个CYP2C19*2等位基因（CYP2C191/2andCYP2C192/2），愿意参加本研究并签署知情同意书者。

PCI成功标准：

临床心肌缺血的症状缓解或消失，术后狭窄＜20％，TIMI血流达到3级，且不伴有严重并发症（如急性心肌梗塞、急性冠脉旁路移植术（coronarybypassgrafting，CABG）和死亡等）

排除标准：

急性心肌梗死；

活动性出血及既往有出血性疾病史；

口服华法林进行抗凝；

采血前1周内有使用GPⅡb/Ⅲa拮抗剂；

对阿司匹林、氯吡格雷及低分子肝素存在禁忌症；

左室射血分数（EF）＜30％;

白细胞计数＜3,000/mm3；

血小板计数＜100×

109/L；

天冬氨酸转氨酶和谷丙转氨酶水平≥正常值上限3倍；

血肌酐≥2.5mg/dL；

3个月内的脑血管事件；

伴发严重疾病，预计存活时间不超过1年;

无法参加实验者。

整个实验方案得到了福建省立医院伦理委员会的批准。

受试者在参与临床试验前都签定了知情同意书。

中国临床试验注册号为ChiCTR-TRC-13003596。

CYP2C19*2基因型和ADP诱导的血小板聚集性检测在福建省立医院临床中心实验室和福建省立医院临床实验室分别完成。

所有入选研究对象均记录性别、年龄、身高、体重、体重指数（BMI）、血压水平、吸烟情况及有无糖尿病史、血胆固醇、甘油三酯、血小板计数、血肌酐水平、支架植入数量，受试期间所服用药物等基本临床资料。

高血压定义为收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg，和/或使用抗高血压药物。

糖尿病定义为空腹血糖≥7.0mmol/L，75g口服葡萄糖耐量试验2h后血糖≥11.0 

mmol/L和/或自述现接受糖尿病治疗（胰岛素或口服降糖药物）。

高胆固醇血症定义为总胆固醇（TC）＞5.18mmol/L（200mg/dL）。

记录的服用药物包括入组前两周内服用的糖尿病、高血压或降糖药物。

PCR检测CYP2C19*2基因多态性

根据说明使用TIANampDNA试剂盒（TiangenBiotechCo.,Ltd.,Beijing,China）将基因组DNA从200μL外周钾乙二胺四乙酸抗凝血中提取。

通过聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测CYP2C19*2（681G＞A;

rs4244285）基因型，使用MultiGene 

梯度PCR扩增仪（TC9600-G-230V,Labnet 

International,Inc.,Edison,NJ,USA）。

25µ

l反应体系包括1.0mlDNA样本，0.8 

ml 

正反引物 

（forwardprimer 

5´

-CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3´

andreverse 

primer5´

-GTAAACACACAACTAGTCAATG-3´

），2.0 

mldNTPs，2.5 

ml10´

PCR缓冲液 

（Mg2+），17.6 

灭菌纯化水以及0.3mlTaqDNA聚合酶（XiamenTagegeBiotechnologyCo.Ltd.,China）。

PCR反应条件：

变性94°

C5分钟；

94°

C30秒，56°

C20秒，72°

C20秒进行35个循环；

最后延伸 

72°

C3分钟。

PCR产物限制性酶切分析，使用SmaI（XiamenTagegeBiotechnologyCo.Ltd.,China）于30 

℃浸渍5-6小时。

GG型酶切后产生212bp、109bp2个片段,GA型酶切后产生321bp、 

212bp、109bp3个片段,AA型产生321bp1个片段,并经ImageMasterVDS-CL（GEHealthcareLife 

Sciences,Uppsala,Sweden）观察，ABI3700全自动测序仪证实。

2009年7月至2010年7月，304名选择性PCI患者术前接受CYP2C19*2 

PCR-RFLP检测。

其中140名为CYP2C19*1/*1（681GG）基因型，130名为CYP2C19*1/*2（681GA）基因型,34名为CYP2C19*2/*2（681AA）基因型。

实验设计

实验流程图见图1。

采用电脑产生随机数字和密封信封将符合纳入标准的90例，随机分为2组（每组45例）：

所有病人，包括双联抗栓组和联合治疗组，术前6小时均口服拜阿司匹林300mg，氯吡格雷负荷剂量300mg，术后口服拜阿司匹林300mgqd，一月后改为100mgqd，氯吡格雷75mgqd，口服12月。

联合治疗组在分组后6小时内，服用脑心通胶囊负荷剂量3.2g，随后服用脑心通胶囊1.6gtid并连续使用3个月以上。

脑心通胶囊 

0.4g/capsule（Compilationof 

TheNationalStandardofChineseTraditionalMedicine 

No.WS-10001[ZD-0001]-2002;

batchNo.Z20025001） 

脑心通由咸阳步长制药有限公司生产。

波立维（硫酸氢氯吡格雷）75mg（批次 

No.J20080090）由赛诺菲-安万特集团生产。

阿司匹林 

100mg 

（批次 

No.H20080331）由拜耳公司生产。

血小板聚集率测定

血小板聚集率测定在收集血样2h内，使用血小板聚集仪（普利生公司LBY-NJ4）检测。

简要叙述过程，用注射器（粗针）抽取静脉血2ml于枸橼酸钠抗凝管中（至少要采集10ml全血，先放入采血管2ml，最后将剩余血液弃掉或做它用），3.8％枸橼酸钠抗凝血3ml以700rpm离心四分钟，吸取上层血浆0.6ml于EP管内以制备富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）；

将剩余全血于3500rpm离心10分钟，上清即为贫血小板血浆（platelet-poorplasma，PPP）血浆。

将300ul“PPP”血浆加入比色杯内，插入比色孔，进行调零。

取出比色杯，甩干杯内的血浆，加入300ul“PRP”血浆及搅拌子一个，插入比色孔，按相应的序号键，屏幕显示：

wait—PRP浓度（数值）—ADP.此时每个比色杯内各加入5ul的ADP诱导剂（SIGMA-ALORICH公司，美国）。

每加一个ADP即按相应的序号键开始检验。

血小板聚集反应持续5分钟，分析参数为最大的血小板聚集率（Aggmax）和第5分钟血小板聚集（Agglate）。

Aggmax 

主要反映了血小板P2Y1和P2Y12受体的活性，而Agglate则更多反映的是血小板P2Y12受体的活性；

血小板聚集抑制率IPA（％）=基线血小板聚集率－抗血小板治疗后的血小板聚集率）/基线血小板聚集率×

100，血小板聚集解聚率=（[Aggmax－Agglate]/[Aggmax]）×

100，两者可以反应抗血小板药物对血小板功能的抑制程度。

随访

对所有90名入选患者均进行为期12个月的随访，随访时间为1，3，6，12个月。

术后主要观察指标：

1.PCI术前（基线）血小板功能及术后7天血小板功能检测：

ADP诱导的血小板聚集率；

2.通过再入院记录、门诊和电话对入选患者随访，观察再发不良心血管事件及出血事件的发生情况。

再发不良心血管事件包括心源性死亡、心脏骤停、急性冠脉综合征（ACS）再次住院。

符合下列一项即诊断为ACS：

不稳定性心绞痛（临床表现以及新发心电图改变，但无心肌坏死标志物改变）或急性心肌梗死伴有心肌坏死标志物改变（肌钙蛋白或CK-MB），包括ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死。

心源性死亡或猝死根据既往心肌梗死、充血性心力衰竭或恶性室性心律失常判断。

出血事件根据TIMI出血标准判定[]。

所有病人均正常饮食并戒烟。

4. 

数据处理

采用Hardy-Weinberg平衡检验样本群体代表性，正态性检验方法采用K-S检验法（Kolmogorov-SmirnovTest），符合正态分布的计量资料以

±

s表示，采用独立样本t检验或成对t检验比较。

计数资料以频数（百分数）表示，组间比较采用χ2检验。

多组均数间比较采用方差分析（ANOVA）, 

方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Game-Howell检验。

一年MACEs累计发生率使用Kaplan-Meier 

方法比较。

P＜0.05有统计学意义，所有数据应用SPSS16.0软件进行统计学处理。

结果

患者特征及随访

所有的304名患者均接受了基线血小板功能和CYP2C19基因型检测，其中164例（53.94％）患者具有CYP2C192多态性，最终90例（62例CYP2C19 

*1/*2 

和28例CYP2C19 

*2/*2）入组（图1），实验组间基线特征均匹配（表1和表2）。

联合治疗组与双联抗栓组在5mol/LADP刺激下基线血小板聚集值（Aggmax,Agglate）无显著差异（表3）。

此外，两组间基线血小板抑制百分比无明显差异（图3）。

两组治疗方案依从性良好，所有患者均无中断治疗，故开始治疗7天后可评估所有患者的血小板功能。

所有患者剩余药片均符合研究计划。

对90例患者达到了12个月的随访。

联合治疗组中服用NXT时间，20例服用时间3个月，15例为6个月，10例为12个月。

尽管在双联抗栓组和联合治疗组分别有14例及6例患者发生MACEs（P＜0.05，表4），但两组均无发生心源性猝死以及主要和轻微出血事件。

ADP诱导的血小板聚集情况

7天治疗后，与相应的基线指标相比，两组Aggmax和Agglate均表现出一定程度降低（P均 

＜0.01），联合治疗组Aggmax和Agglate值在明显低于双联治疗组（表3）。

联合治疗组5μmol/LADP刺激下Aggmax和Agglate的IPAs显著高于双联治疗组（Aggmax 

IPA:

42.33％±

15.99％ 

VS20.76％±

15.18％，平均差21.57％，95％可信区间CI：

15.04％-28.10％，P＜0.01；

Agglate 

54.68％±

18.26％ 

VS21.47％±

29.18％, 

平均差33.21％, 

95％CI：

23.02％至43.41％，P＜0.01,见图2）。

随访结果

双联治疗组的MACEs发生比联合治疗组更频繁（31.11％ 

VS13.33％，P=0.043，OR=0.341，95％CI0.117 

to 

0.990，见表4），12个月随访期间Kaplan-Meier生存曲线分析显示，双联治疗组的MACEs发生率比联合治疗组高（P=0.044，图4）。

MACEs主要为ACS引发的再入院。

讨论

氯吡格雷活性代谢物（R-130964）是一种次级代谢产物。

众多CYP酶，包括CYP3A，CYP2C19，CYP2C9，CYP2B6和CYP1A2，在两个连续代谢过程中参与R-130964的形成。

其中，在CYP2C19和3A4同功酶发挥主要角色。

除了CYP酶基因多态性，氯吡格雷抵抗的另一种机制氯吡格雷活化所需的CYP同工酶的竞争性抑制。

钙通道阻滞剂是同功酶CYP3A4的竞争性抑制剂，一项针对PCI病人的小规模观察性研究已经表明，这种相互作用对氯吡格雷活性起到重要作用。

质子泵抑制剂（PPIs）是CYP2C19的竞争性抑制剂。

并且PPIs往往伴随氯吡格雷给药，以减少ACS患者，尤其PCI术后胃肠道出血风险。

近期研究者已观察到氯吡格雷与广泛使用的PPIs之间潜在的相互作。

一些证据表明奥美拉唑与氯吡格雷的交互作用可降低氯吡格雷抗血小板效果，并指出这种相互作用主要涉及CYP2C19同功酶的竞争性抑制。

临床上，几个回顾性分析同样观察到，PPIs和氯吡格雷联用时可增加心血管不良后果。

与此相反，增加CYP2C19活性，临床医生需要重视圣约翰麦芽汁在包含CYP2C19酶作用药物的治疗方案中的增减。

一项在健康志愿者中开展的研究发现，圣约翰草可放大氯吡格雷的效果，将无反应者变为反应者。

既往人体研究已经表明，CYP2C19活性易受草药和天然产品诱导，包括圣约翰草，银杏，以及中国中草药合剂茵栀黄（也称为Jaundiclear）。

NXT配方包括补阳还五汤、蝎和水蛭等。

研究证实补阳还五汤能改善气虚血瘀患者冠状动脉心脏病，并能降低大鼠C反应蛋白和CD40水平。

本研究表明，联合NXT能增强PCI术后CYP2C19*2患者氯吡格雷的血小板抑制效果和MACEs事件发生。

结果提示联合1.6gNXT每天三次可增加33％Agglate，并减少34％MACEs风险。

了解具有削弱治疗效果的药物相互作用是极其重要的，尤其在多药治疗的情况下。

基于氯吡格雷的双联抗血小板治疗是PCI术后治疗重要组成部分,其疗效受到多种因素的影响。

转化医学和循证医学研究数据表明，超过50％中国人口携带CYP2C19基因多态性，此现象与氯吡格雷抵抗关系密切。

中药复方制剂通常具有复杂成分和多治疗靶点。

我们的数据表明携带这种基因的气虚血瘀患者服用NXT可能显著改善其氯吡格雷低反应。

NXT联合氯吡格雷防治冠脉血栓形成的机制可能与多个作用靶点有关，其中包括增加CYP2C19酶活性以及抑制炎性因子。

尽管我们的研究结果令人激动，但仍需大规模，多中心，前瞻性临床试验中来证实。

研究可为CYP2C19基因多态性患者氯吡格雷低反应提供新的治疗方案，并为多靶点调控治疗的整合医学模式提供新证据。

综上，与每天75毫克的氯吡格雷相比，每天附加三次1.6克BNJ，可使CYP2C19基因变异者血小板抑制率增加33％，PCI术后一年内不良心血管事件再发风险降低34％。