甜瓜白粉病抗病基因的SSR标记Word文档格式.docx
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甜瓜抗病品种PMR5、感病品种黄河蜜3号，以PMR5为母本，黄河蜜3号为父本杂交得F1，F1自交得F2。
2008年4月初将双亲、F1和F2群体材料播种，5月份进行苗期白粉病菌接种鉴定。
苗期接种试验在甘肃农业大学农学院试验基地塑料大棚内进行。
2.1.2病原材料
甜瓜白粉病菌采自皋兰县什川大棚的甜瓜植株上，活体保存，备用。
2.1.3SSR引物及试剂
本实验所用化学试剂均为市售。
选择的200对SSR引物，由上海生物工程有限公司合成。
PCR扩增反应试剂（10×
PCRBuffer、Mg2+、dNTP、Taq酶）均购自天为时代兰州百澳生物公司。
2.2方法
2.2.1DNA提取前期的植物材料准备
将材料中种子采用同样的方法种于大棚内，当植株长到四到五片真叶从各品种植株上分别取一片真叶用液氮速冻后置于-70℃温度下保存。
用摩擦接种法接种白粉病病原菌。
当感病对照品种黄河蜜感病普遍率达100%时，即可调查试验材料单株侵染型。
本研究选用了中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室的病情分级标准，将发病程度分为6个级别：
0级，无病症；
1级，病斑面积占总叶面积的1/3，白粉模糊；
2级，病斑面积占总叶面积的1/3-2/3，白粉明显；
3级，病斑面积占总叶面积的2/3以上，白粉厚，连片；
4级，白粉浓厚，叶变黄，坏死；
5级，坏死叶面积占总叶面积的2/3以上。
并且调查时每个单株自下而上、由重到轻调查5片叶子，根据侵染型级别及各级侵染型数目确定抗、感类型的划分标准。
对F2抗、感病株进行统计。
抗病亲本PMR5，感病亲本黄河蜜3号，F１，F２等四个材料在甜瓜苗期取样，于各单株上取3～4片新鲜叶片，并单株挂牌标记，取下的新鲜叶片装入保鲜袋中，用冰盒带回实验室，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
用液氮速冻后-70℃冷冻保存，DNA提取前一天转入-20℃冰箱。
2.2.2基因组DNA的提取
1）准备工作
●将洗干净的研钵、研杵预先放进冰箱冷冻室预冷，可减少液氮用量。
●田间采取的新鲜叶片放入装有冰的冰盒中备用。
●将无水乙醇、异丙醇放入冰箱预冷。
●在2%CTAB（2%CTAB，100mmol/LTrispH8.0，20mmol/LEDTA，1%PVP，1.4mol/LNaCl）中加入β-巯基乙醇，使溶液终浓度达到2％（v/v）。
●将加入β-巯基乙醇的CTAB抽提液放在恒温水浴锅中65℃预热。
2）DNA的提取
取新鲜叶片，放入预冷的研钵中加入液氮迅速研磨成细粉状，并快速转移到2ml灭菌的离心管中，立即加入750μL预热的CTAB提取缓冲液，充分混匀后在65℃水浴中放置30～60min，其间不时的颠倒混摇数次。
（注意：
样品的量不能太多，否则CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。
）
●加入等体积氯仿：
异戊醇（24:
1，v:
v），轻缓颠倒离心管充分混匀；
●在室温下12000rpm离心10min；
●取上清液加入等体积预冷的氯仿：
l），将离心管缓慢颠倒几分钟，使管内充分混匀。
在4℃下，12000rpm离心10min，将上清小心转移到新的2ml离心管中。
吸取2/3的上清即可，不能吸取太多，防止将氯仿：
异戊醇或沉淀吸入，降低DNA的纯度。
●加入上清体积2/3预冷的异丙醇，缓慢混匀，颠倒10次。
置于-20℃下沉淀2h，在4℃下，12000rpm离心10min；
●弃上清。
加入200μLTE溶液（稍多加），溶解DNA；
加2ul10mg/mlRNAse37℃，水浴30min；
●加入等体积预冷的氯仿/异戊醇（24:
l）轻轻混匀，静置10min，在4℃下，12000rpm离心10min；
●取上清加入2倍体积冷的无水乙醇。
-20℃放置30min或更长时间，在4℃下12000rpm离心10min，倒掉上清液；
●用70%的冷乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm离心5~8min，倒掉上清液；
●再用无水乙醇漂洗1次。
4℃，12000rpm离心5~8min，倒掉上清液;
●置于超净工作台上吹干，或用冷冻真空干燥机抽干；
●加100μLddH2O或TE（PH8.0）缓冲液使沉淀溶解，-20℃保存。
2.2.3SSR引物多态性筛选
用所选取的200对微卫星引物对抗病亲本PMR5和感病亲本黄河蜜进行扫描，筛选出在两亲本间具有多态性的引物。
2.2.4非变性聚丙烯胺凝胶电泳检测[7]
1）胶板的制备
●玻璃板的清洗：
用温水沾上洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，然后用酒精擦洗、干燥。
吸取15～16μL剥离硅烷于凹口玻璃板上，并用餐巾纸将其涂抹均匀，再用95％酒精稍微涂抹。
操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后才进行玻璃板组装；
●电泳槽的组装，水平仪检测（灌胶口稍微高一点）；
●胶的配制：
50ml6％聚丙烯酰胺胶+150～200μL10%的过硫酸铵（AmmoniumPersulphate）+40～50μLTEMED（N,N,N'
N'
-四甲基乙二胺），迅速轻轻摇匀，小心不要引入气泡。
加入APS和TEMED后要迅速灌胶；
●灌胶：
把胶沿灌胶口轻轻灌进，同时轻轻敲打，防止出现气泡。
待胶流到底部，在灌胶口轻轻插入梳子，梳齿朝外，让其聚合至少2小时（若让胶过夜，在胶的两口铺上湿滤纸、保鲜膜以防胶干）。
2）电泳
●25μLPCR扩增产物中加入5μL甲酰胺上样缓冲液，95℃变性8min，然后立即冰浴；
●将1800ml1×
TBE缓冲液加入到电泳仪的正极槽和负极槽；
●装上胶板，取掉梳子，清除气泡；
●恒功率50W预电泳20min；
●清除气泡，加入5μLPCR扩增产物，40W恒功率电泳，电泳时间可视SSR扩增产物的分子量而略微加以调整；
●电泳结束后，小心分开两块玻璃板。
3）银染
银染方法参照Sanguinetii等的方法，部分步骤略做改进。
银染全部过程在摇床上进行。
●固定与脱色：
取合适的塑料盒，倒入10％乙醇（50ml）+0.5％冰醋酸溶（2.5ml）定容至500ml在摇床上轻轻摇动固定5～10min，直至指示剂的颜色褪去为止。
●水洗：
用蒸馏水水洗10～15min。
●银染：
把胶放入染色液1gAgNO3+0.5ml10%乙醇（50ml）+0.5％冰醋酸液（2.5ml）定容至500mlddH2O，在摇床上轻轻摇动染色6min；
蒸馏水迅速水洗5s。
●显影：
将胶放入显影液（6gNaOH+200ml蒸馏水+1ml甲醛）中轻轻平行摇动，直至条带出现，清晰为止。
●冲洗：
用ddH2O冲洗2次。
●实验结果记录分析：
胶板可永久保存，或进行拍照。
2.2.5抗病池和感病池的构建[8]
根据Michelmoretal介绍的集群分析分离法，简称BSA（BulkSegregateAnallysis）法，从F2群体中选取若干株极抗病株，将其单株DNA等量混合，构建成抗病基因池；
再取若干株极感病株，将其单株DNA等量混合，建立感病基因池。
用在两个亲本间表现多态性的引物扫描抗池和感池，寻找在抗池和感池间表现多态性的引物。
3结果与分析
3.1甜瓜基因组DNA的提取
采用CTAB法[9]-[11]提取甜瓜材料基因组DNA，用紫外吸收法测定DNA样品纯度后，计算基因组DNA浓度，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测稀释结果，检测结果表明供试材料的基因组DNA主带清晰而集中，说明DNA提取完整、无降解现象，适合于SSR分析。
甜瓜基因组部分DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。
图1.供试甜瓜材料的基因组DNA
Fig1.GenomicDNAextractedfrommelonmaterialstested
3.2SSR引物在两亲本间的扩增
以两亲本（PMR5、黄河蜜）为材料对200条SSR引物进行PCR扩增，筛选在两亲
PsPRPsPRPsPRPsPRPsPRPsPRMPsPRPsPRPsPRPsPR
图2部分SSR引物在两亲本间的筛选
Fig2ScreeningofsomeSSRprimersbetweentwoparents
M：
Maker；
PR：
抗病亲本；
PS：
感病亲本
M:
Maker；
Parentofresistance；
PS：
Parentofsusceptible;
本间具有多态性的引物（图2）。
结果表明其中有193对引物在两亲本间均能同时有效扩增，其中有46对引物在亲本间表现多态性表1。
表146对在亲本间表现多态性的SSR引物
Table146SSRprimersintheperformanceofpolymorphismbetweenparent
Primer名称
序列（5'
to3'
/3'
to5'
Tm（℃）
CMGA15
CGGCAAGACGATTGGCAGC
ATCACCGTAGCGAAGCACC
55
CMCT44
TCAACTGTCCATTTCTCGCTG
CCGTAAAGACGAAAACCCTTC
58
CMGA104
TTACTGGGTTTTGCCGATTT
AATTCCGTATTCAACTCTCC
54
CMCTT144
CAAAAGGTTTCGATTGGTGGG
AAATGGTGGGGGTTGAATAGG
CMGA172
CAATCGCAGATACTTCCACG
TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT
59
CMTC123
CGGATTGTACTTATTGCCAAG
CATGTGCATGTGTGCATGTAC
57
CMTC158
CCCCCATATTCATCAAAACT
TCAGCTCACTTTTCCATTCA
CMTA170a
TTAAATCCCAAAGACATGGCG
AGACGAAGGACGGTTAGCTTT
CMGA165
AGTTCGGTTTAACTACCCACG
TTCAACTACAGCAAGGTCAGC
CSCT335
CCTTCACTTCCATCTTCATC
CGGTCCTTCATTTCATAGAC
56
CMAT35
GTGGGTCATCATTATTGTTA
GCTTTTAGCCTATTAAGTTGC
52
CMBR7
AAAATGAATGGGAGTGCGTG
GCCTTCCTTTTCACCATCAA
CMBR22
CCAAAACGACCAAATGTTCC
ATACAGACACGCCTTCCACC
CMBR24
TGGGGTTGTCAATACAGCAA
AAAATGAATGGGAGTGTGTGG
CMBR27
AAACAAACATGGAAATAGCTTTCA
TAGTTGGGTGGGCTAAAGGA
CMBR39
GGCAAAGAAGAAGGAAGAGTGA
AGAGATGCTCCCTACACTGC
CMBR43
TCAAGCAAACCCTAATCGGT
CSAT425
TAGGGCAGGTATTATTTCAG
ACGGACTGATTTAGTATAGGC
53
SSR25
ATCATTGGATGTGGGATTCTC
ACAGATGGATGAAACCTTAGG
SSR749
AATCCCAAATCACACCCAAA
CCAGCTTTTGATGCCTCTCT
CMCTN4
AAAACAAAAGCTCTCCACGA
CTTTCCTTTATTATGCCTACG
CMTCN6
GCATTGCTCGATCAGTTTTAC
ACTCCGTCAAGATCCCAAAA
CMGAN12
TTTTTGTCGTTATATGAGGG
GTTGCATAATGCTAATTTGG
CMTCN18
ACCAATCCATCACTCTCACT
GAAAGAATGGGGGAAAAGAG
CMGAN24
TAACTATGATGAAGAGTT
TGCCAAACTATAATCACACTA
CMTCN30
GGAGGGAAAGGAAAGAGAGA
GGCAAGAAGATGGCAAAGAT
CMCTN35
CCAATAATGTAATCGTCTTGG
GTTCCAAACTTTCTACCAATCA
CMCTN38
TAAAACACTCTCGTGACTCC
GATCTGAGGTTGAAGCAAAG
CMAGN45
CCCACAAGAGAGAGAGAGAG
GTGTGACAGGTAGATTGTTGG
CMTCN56
CTTTTCTCTTCTTCTATTCTC
ATCCAAAAGGAATCGGAAAG
CMGAN80
ATATTGATTGCTGGGAAAGG
CTTTTTTGGCTTTATTGGGTC
CMGAN92
GAGAGAGAGAGAGAGATG
GGTTGGGTACTCCGAGTTA
CMCT126
CTTTAGGTGTGAGATTGGTGG
GCACATCATTGGAGTAACTCG
CMTC51
ATTGGGGTTTCTTTGAGGTGA
CCATGTCTAAAAACTCATGTGG
MC219
TTCAGGGATTGGACCCTCTA
TCCAAATCTCTGGCAATCGAT
Ⅲ
GCTAACGTATGCGTAGTACGTAG
ATCGGGCTATACCGGAATTCGGC
62
Ⅶ
CCCTTTGAGATTGAGGATG
AAATGCGAACCTTTTCAAG
CMTCN66
CTCCGATCAATTTTACATCT
GAATAAACTTGGTGTCCAAC
CMATN38
CMTCN41
CCCCAAGATTCGTATTAATC
TGGTAGTAGAGATGATATAC
CMTCN50
TCTACTTCCATGAATCCATC
TAGAATGGTTAGGAAACCCT
CMAGN73
ATCCAACTCGACCAAGAAAC
CAGCTCTACAACAACATCTC
CMAGN79
CTTCACTAAAACTACAAGAG
TTCCAACTTATTCATCCCAC
CMTA170b
ATTGCCCAACTAAACTAAACC
CACAACACAATATCATCCTTG
CMTCN14
TATATTGGCTTTGGCTCTCG
GATTCGTTATCTCGACCAAC
CMAGN75
TGGGTTTTCTTCTACTACTG
TGCTTTTACTCTCATTCAAC
3.3SSR引物在两池间的扩增
选取极抗和极感单株的DNA分别等量混合，构成抗病池和感病池，采用SSR技术，对在亲本间有多态性的46对引物进行进一步筛选，其中引物CSAT425在抗感池间稳定扩增出一条约98bp的差异条带，初步表明引物CSAT425与目标基因连锁（图3）。
98bp
图3抗、感病池间不同SSR引物的筛选
Fig3ScreeningofsomedifferentsSSRprimerswithresistantandsusceptiblegroups
Maker
；
Bs：
感病池；
BR：
抗病池
susceptiblegroup；
resistantgroup
3.4多态性SSR引物CSAT425的F2群体检测
PRPs123M4567891011121314151617181920
图4引物CSAT425在部分F2单株中的验证
Fig4.ThepartsofF2plantswithSSRmakerCSAT425totests
PR抗病亲本；
Ps：
感病亲本；
1-20：
部分F2代单株。
.
M：
PR：
PS：
Parentofsusceptible；
1~20：
TheF2plants．
用引物CSAT425对F2群体单株进行扫描。
两亲本的特异带分别记做A型带（抗病亲本的带型一致），B型带（与感病亲本一致的带型）。
抗病池扩增出与抗病亲本相一致的特异带，记做A型带。
感病池扩增出的条带和感病亲本的特异带大小相同，记做B型带。
提取180株F2群体单株DNA，用抗、感池筛选获得的与目标基因连锁的引物CSAT425扫描F2群体，进行扩增后，统计抗病亲本带型、感病亲本带型。
在感病植株中有9株单株出现了CSAT42598，抗病植株中有15株的CSAT42598消失，重组率为13%。
图4为在甜瓜抗、感池间筛选出的多态性引物CSAT425在F2代分离群体的检测。
图中所示的20个序号中，1～20为F2代分离群体，其中17、18号的表型为抗病株，但标记的特异条带消失，其余标记结果与表型相符。
4讨论
4.1PCR体系各组分的影响
SSR标记包括两个步骤：
PCR反应和电泳检测。
针对不同作物建立相适应的PCR反应体系，是取得试验成功的关键[12]。
影响SSR-PCR稳定性的因素有内部和外部因素。
内部因素即PCR反应体系中的各组分的影响，其中包括模板DNA的纯度和浓度、引物的质量和特异性、Taq聚合酶的用量、MgCl2、dNTP的浓度。
外部因素主要包括PCR仪的型号、PCR反应程序的设定、电泳条件等。
为了得到高效的扩增产物，在进行SSR扩增前，DNA扩增的条件首先需要优化，最终实现扩增可重复的SSR图谱。
在本试验中，我们在前人研究的基础上，分别对SSR反应体系（模板浓度、10×
buffer、Tag聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度）进行了摸索研究，得到一套适合本实验要求的SSR反应条件：
反应体系（25.0μl）中含有10×
TaqBuffer2.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0μL，MgCl2（25mmol/L）2.0μL，2.5U/µ
lTaq酶0.4μL，SSR上、下游引物（5pmol/μL）各2.0μL，其中发现，模板DNA的量在50～200ng之间都能扩增出适于分析的有效条带，说明基因组模板浓度对扩增结果并没有明显影响，这表明SSR技术对DNA质量要求不高。
4.2关于BSA法
BSA（集团分离分析法，又称分离体分组混合分析法或混合分组分析法，BulkSegregateAnallysis）分析法首次由Michelmore等提出并成功地在莴苣中筛选出与目的基因相连锁的标记。
该方法首先从一对具有目标基因的表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成2个亚群或集团。
将每群的DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”（genepool），然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。
在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样才能完成真正意义上的对基因的标记定位。
由于建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上就应主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池，这就排除了遗传背景的影响，使研究结果更为准确可靠[13]。
在实验中运用BSA法需要注意以下一些问题：
在亲本的选择上要有科学的性状选择标准，并对亲本进行性状鉴定，利用两亲本杂交后分离的F2代构建基因池。
本实验中选择的两亲本（PMR5，黄河蜜）分别为抗病和感病品种，在目标性状上存在较大差异，可用于BSA法进行分子标记。
实验材料由PMR5×
黄河蜜杂交的F1代中的一株单株繁衍而来的F2群体。
在选择建池单株时要根据调查记录的材料来选择，要确定选择那些对白粉病病原菌有极端表现的植株。
两池内各株的DNA要等量混合，两亲本的遗传背景比较一致时，建池植株数可少至5株，如遗传背景差距较大，可增加株数。
在本实验中，我们选择了整个植株都覆盖白粉的作为极端感病植株。
以极端感病株周围植株的叶片、叶柄、茎以及下胚轴都没有白粉的作为极端抗病植株，利用紫外吸收法计算基因组DNA浓度，根据计算值将基因组DNA分别稀释成等浓度，从而保证两池内的各株DNA能够等量混合。
才能避免将个别单株之间的差异作为所要筛选的目的标记而产生假阳性。
本试验中筛选出的CSAT42598标记与抗病基因的交换率为13%，其遗传距离相对有些远，但在没有找到更好的标记之前，该标记可以用于相关材料抗病基因的辅助选择。
其与抗病基因连锁更紧密的标记有待于今后进一步的试验研究确定。
参考文献:
[1]李丽，郑晓鹰，KlockeE．利用RAPD分子标记
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