饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法Word格式.docx
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兰尊海，河南海瑞正检测技术有限公司，主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人：
兰尊海：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和技术推广。
单慧燕：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和应用。
易善平：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制校订和应用。
薛宁：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定。
许亚楠：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的校订和应用。
李培娜：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责此标准方法的应用。
孙世雯：
河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准校订和应用。
4、主要内容的确定
（一）与国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》的对比：
1.出峰时间进行比较
根据标准要求，用高效液相色谱法和国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》，对氨基酸样品进行分析，出峰时间如图1、图2所示，氨基酸分析仪出峰完全在110min左右，而高效液相色谱法的出峰时间在36min左右，大大节省了检测时间，提高了工作效率。
图1氨基酸自动分析仪-氨基酸色谱图
图2高效液相色谱法-17种氨基酸色谱图
2.结果准确性进行比较
选用浓缩料和脱脂鱼粉两类饲料样品，分别进行本方法和国标方法GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》，两种方法进行比对，结果从表1可以看出，两组数据的相对偏差分别为0.50%、0.28%，远远小于标准要求4.0%的相对偏差，说明高效液相测定氨基酸结果准确可靠，方法可行。
表1两种方法氨基酸的测定结果
组分名称
本标准GB/T18246本标准GB/T18246
浓缩料
脱脂鱼粉
天门冬氨酸（asp）
3.28
3.19
6.30
6.22
谷氨酸（glu）
5.49
5.46
9.70
9.84
丝氨酸（ser）
1.37
1.36
2.68
2.84
精氨酸（arg）
2.23
2.20
4.20
4.30
甘氨酸（gly）
1.24
1.20
4.55
4.52
苏氨酸（thr）
1.08
1.07
2.99
3.01
脯氨酸（pro）
1.34
3.02
2.90
丙氨酸（ala）
1.25
4.45
4.37
缬氨酸（val）
1.35
3.60
3.45
蛋氨酸（met）
0.57
0.56
2.15
2.09
胱氨酸（cys）
0.26
0.53
0.50
异亮氨酸（ile）
1.31
3.14
3.06
亮氨酸（leu）
2.19
2.16
5.53
5.34
苯丙氨酸（phe）
1.45
1.44
2.92
2.87
组氨酸（his）
0.87
1.85
1.87
赖氨酸（lys）
1.86
5.80
5.82
酪氨酸（tyr）
0.89
0.88
2.24
2.30
氨基酸总和
27.99
27.71
65.67
65.30
相对偏差（%）
0.28
（二）高效液相色谱法实验条件的优化：
1.样品前处理优化条件
酸解剂用量的优化：
分别取酸解剂5mL、10mL、15mL，由表2实验结果表明酸解剂为5mL时，结果较低，说明水解不完全，在酸解剂用量为10mL和15mL时，结果一致，说明水解完全，本着节约的原则，为减少浪费，10mL为最佳酸解剂的用量。
表2不同酸解剂用量测定结果
组分名称
酸解剂（mL）
5
10
15
5.96
6.28
8.98
9.63
9.57
2.32
2.38
3.84
4.10
4.05
4.34
4.62
4.63
2.76
2.96
2.98
2.89
3.10
3.09
4.24
4.56
3.68
3.67
2.02
2.22
0.46
0.52
3.05
5.08
5.45
5.44
2.72
1.63
1.74
1.68
5.40
5.74
5.71
2.06
60.84
64.94
64.71
2.衍生温度的优化:
将衍生温度设置为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃五个梯度，其余参数同标准要求，结果如表3所示，衍生温度在50℃到60℃时，结果处于上升趋势，在60℃到65℃时，结果稳定，在70℃时，结果明显偏高，由此说明，温度低于60℃时，衍生不完全，结果偏低；
温度高于65℃时，衍生试剂里的有机试剂易挥发，导致结果偏高。
综合考虑，衍生温度选定在60℃时较为合适。
表3不同衍生温度测定结果
衍生温度（℃）
50
55
60
65
70
5.50
5.99
6.29
6.27
6.63
8.82
9.27
9.66
9.59
2.29
2.26
3.85
4.04
4.09
4.08
4.16
4.49
4.61
4.58
4.82
2.83
2.95
3.15
2.93
3.08
3.21
4.25
4.39
4.53
4.73
3.53
3.66
3.64
3.76
2.11
2.12
2.33
0.48
0.54
0.55
3.23
5.16
5.25
5.43
5.65
2.51
2.73
2.75
2.88
1.49
1.65
1.77
5.37
5.56
5.75
5.73
5.92
1.98
2.18
2.17
2.27
60.19
62.69
64.97
64.69
67.30
3.衍生时间的优化
将衍生时间设置为：
20min、25min、30min、35min，结果如表4数据可以看出，衍生时间由20min到30min时，结果呈上升趋势，表明衍生时间低于30min时，衍生不完全，实验结果偏低；
衍生时间为30min和35min时，结果相同，说明在30min时样品已经衍生完全，本着提高效率、节约资源的原则，确定30min为最佳衍生时间。
表4不同衍生时间实验结果
衍生时间（min）
20
25
30
35
5.62
6.02
8.81
9.22
9.64
9.67
2.10
2.37
2.35
3.79
3.92
4.12
4.15
4.33
4.70
4.67
2.77
3.13
4.21
4.57
3.43
3.52
3.62
0.51
3.11
5.10
5.20
2.55
2.64
1.56
1.73
5.78
2.03
2.08
59.81
62.23
65.38
65.31
4.方法精密度实验
取试样溶液一份，按照本标准要求的色谱条件重复进样6次，结果如表5所示,氨基酸各组分的相对标准偏差在0.63%～2.28%之间，实验结果表明：
该方法测定氨基酸有较好的重复性。
表5方法的重复性实验结果
测定次数
RSD（%）
1
2
3
4
6
6.47
6.43
6.31
6.37
6.25
6.38
1.26
9.74
9.71
9.68
9.44
1.13
2.25
2.28
0.95
4.18
4.14
1.15
4.74
4.65
1.54
2.94
2.86
1.02
3.04
2.97
2.04
4.47
1.99
3.82
3.56
2.21
0.83
1.41
3.22
3.24
0.63
5.63
5.57
5.59
5.51
5.58
1.22
1.84
1.88
2.13
5.84
1.09
2.07
2.01
1.18
66.34
65.73
65.65
65.16
65.63
65.45
1.10
5、与有关的法律、法规和强制性国家标准的关系
本标准为新制订的地方标准，在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针政策、法律法规，以符合国家相关规范性文件为前提，在法规许可范围内提出科学合理的检测要求，与现行的国家相关法律、法规无冲突和不一致之处，遵循了政策性和协调同一性的原则。
6、标准实施的建议
该项技术标准的制定，试验数据充分、科学性强，可作为河南省推荐性地方标准在饲料中氨基酸的测定工作中进一步推广应用。
由于本标准为首次制定，建议全省的检测机构和企业能深入理解和熟练运用该标准，同时加大标准宣贯力度，建议作为推荐性地方标准发布实施。
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