21 微生物的实验室培养二教案Word下载.docx

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2.制备步骤

特别提醒　制备固体培养基的一般步骤可简记为：

算、称、溶、灭、倒，即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

3．倒平板操作

1．培养基灭菌后，需要冷却至50℃左右时，才能倒平板的原因是什么？

你用什么办法来估计培养基的温度？

提示　琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不及时操作，琼脂会凝固。

可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

2．分析下图，回答下列问题：

（1）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

提示　通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

（2）从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？

提示　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。

3．怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？

提示　未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。

1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，下列关于倒平板的具体描述正确的是（　　）

①待培养基冷却至40℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板　②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞　③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰　④用左手的拇指和食指完全打开皿盖　⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖　⑥等待平板冷却5～10s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上

A．①③④⑤B．④⑤⑥

C．③⑤D．①②④⑥

特别提醒　　

（1）培养基灭菌后，需冷却至50℃左右时倒平板，原因是琼脂在44℃以下凝固。

（2）倒平板的过程需要进行无菌操作，要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，在酒精灯火焰旁操作进行灼烧灭菌。

2．某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。

请回答下列问题：

（1）对买回来的菌种进行扩大培养，首先需制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料：

______________________________________________________

________________________________________________________________________。

（2）微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的________。

在烧杯中加入琼脂后要不停________，防止______________________。

（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入______________中灭菌。

灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。

如果棉塞上沾有培养基，此试管应____________。

二、微生物的分离与纯化技术

1．纯化大肠杆菌

（1）菌落的概念：

由一个微生物细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。

（2）接种方法：

最常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。

Ⅰ.平板划线法

①原理：

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

在数次划线后培养，可以分离到单个菌落。

②操作：

特别提醒　平板划线操作中三种灼烧的目的不同

项目

目的

沾取菌液前灼烧

避免接种环上可能存在的微生物污染菌种

每次划线前灼烧

杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端

划线操作结束后灼烧

及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者

Ⅱ.稀释涂布平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。

A．系列稀释操作

a．编号为101～106试管中分别盛有9mL水。

b．用移液管吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。

c．从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。

依次类推，完成菌液的稀释。

特别提醒　移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。

B．涂布平板操作

涂布器消毒：

将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中

↓

取菌液：

取少量菌液（不超过0.1mL），滴加到培养基表面

涂布器灭菌：

将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s

涂布平板：

用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀

特别提醒　取出涂布器时，应避免酒精滴落；

燃烧后的涂布器，应冷却后再浸入酒精。

2．菌种保藏方法的比较

临时保藏

甘油管藏

适用范围

频繁使用的菌种

长期保存的菌种

培养基

固体斜面培养基

液体培养基

保藏温度

4℃

－20℃

特点

需不定期转移菌种；

保存时间短；

菌种易被污染或产生变异

保存时间长；

菌种安全性和稳定性高

具体方法

接种到固体斜面培养基上→在合适的温度下培养长成菌落→4℃冰箱中保藏

甘油瓶中装入甘油后灭菌→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存

1．平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？

提示　

（1）接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。

（2）划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。

（3）接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。

（4）划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划线后及时盖上皿盖。

2．在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

提示　划线末端含有的细菌数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。

3．稀释涂布平板操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养？

未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。

如果有菌落生长，说明了什么？

提示　培养未接种培养基的作用是对照。

未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；

若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。

关键点拨　两种接种方法的比较

平板划线法

稀释涂布平板法

用途

一般用于菌种的纯化

一般用于筛选菌株

优点

可对混合菌进行分离

可以计数

缺点

不能计数

操作复杂，若平板不干燥，则效果不好；

若菌液浓度大，则长不出单菌落

培养结果

3．图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法操作的结果。

下列相关叙述中，错误的是（　　）

A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液

B．对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成

C．乙中培养皿中所得的菌落都符合要求

D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端

误区警示　

（1）高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。

（2）两种接种方法中，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数的原因：

只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。

而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。

4．（2019·

四川资阳期中）平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。

下列相关叙述中错误的是（　　）

A．平板划线法要求在培养基表面连续划线，且除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点

B．除第一次划线前需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌

C．如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数

D．“充分稀释”和“连续划线”的目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落

误区警示　平板划线法中的操作要领是“多次划线”，稀释涂布平板法中的操作要领是“充分稀释”，二者虽然操作方法不同，但目的是一样的，即获得由单个细胞繁殖而成的菌落。

如果平板划线法中的划线次数太少或稀释涂布平板法中的稀释倍数不够，则得到的可能是由多个细胞繁殖而来的子细胞群体，其中还可能掺杂着其他杂菌，达不到纯化的目的。

1．判断正误：

（1）倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置（　　）

（2）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用（　　）

（3）平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌种（　　）

（4）对微生物进行计数时最好采用稀释涂布平板法（　　）

（5）需要将一个不接种的培养基放在相同的条件下培养，以检验培养基的灭菌是否合格（　　）

2．（2019·

江苏苏州月考）微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。

如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③④。

下列相关叙述错误的是（　　）

A．划线操作时，将沾有菌种的接种环插入培养基

B．平板划线后培养微生物时要倒置培养

C．不能将第④区域的划线与第①区域的划线相连

D．在第②～④区域中划线前都要对接种环进行灭菌

3．（2018·

安徽淮南二中期中）为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏。

下列有关叙述错误的是（　　）

A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法

B．临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上

C．临时保藏的菌种容易被污染或产生变异

D．对于需要长期保存的菌种，一般采用甘油管藏法，由于是在－20℃条件下培养，因此不必对甘油进行灭菌

4．检验培养基是否有杂菌污染的最有效方法是（　　）

A．将未接种的培养基放在实验桌上培养

B．将未接种的培养基放在窗台上培养

C．将未接种的培养基放在恒温箱中培养

D．将已接种的培养基放在恒温箱中培养

5．请回答下列与大肠杆菌纯化培养有关的问题：

（1）制备培养基：

配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行，培养基在接种前要进行灭菌。

（2）纯化大肠杆菌：

①通过接种环在琼脂固体培养基的表面进行连续划线的操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。

在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这种方法称为。

②用该方法统计样本菌落数时（填“是”或“否”）需要设置对照组？

为什么？

。

（3）讨论分析：

①纯化大肠杆菌时，（填“可”或“不可”）用加入抗生素的方法防止杂菌感染。

②用该方法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，并划线数次，其原因是

③大肠杆菌与酵母菌的最本质区别是