山羊褪黑激素受体1A基因HinfⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析本科毕业论文Word文件下载.docx

山羊褪黑激素受体1A基因HinfⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析本科毕业论文Word文件下载.docx

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2.1PCR扩增结果15

2.2酶切结果15

2.3褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果16

2.4MTNR1A基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析17

2.5MTNR1A基因型与经产产羔数性状的关联分析17

3讨论18

3．1不同山羊品种基因型频率及基因频率差异18

3．2MTNR1A不同基因型对波尔山羊头胎和经产羔数的影响18

参考文献19

致谢20

摘要

本研究以褪黑激素受体1A基因为候选基因，分析该基因多态性对山羊产羔数性状的影响。

采用限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthpolymorphism，PCR-RFLP）方法，检测了65只波尔山羊和51马头山羊褪黑激素受体1A基因HinfⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析。

结果表明，褪黑激素受体1A基因在波尔山羊中存在HinfⅠ酶切多态性，而在马头山羊样本中则无多态性。

在波尔山羊中，检测到AA、GG两种基因型，未检测到AG型；

其中AA基因型个体在出现频率最高，为0.554，GG型为0.446；

A、G等位基因频率分别为0.554和0.446。

性状关联分析结果表明：

波尔山羊的AA基因纯合型头胎平均产羔数比GG基因杂合型多0.07只，加性效应值为0.035，显性效应值为-1.42；

经产羔数的AA型比GG型多0.09只；

加性效应值为0.046，显性效应值为-1.84。

A等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关，该位点主要以加性方式起作用。

关键词：

山羊；

繁殖性状；

褪黑激素受体；

PCR—RFLP

Abstract

Inthepresentstudy，Melatoninreceptor1Agene（MTNR1A）wasanalysedtofindtheassocationwithlittersizeingoatasacandidategene.HinfⅠ-RFLP（RestrictionFragmentLengthpolymorphism，RFLP）ofMTNR1Awasfoundin65Boergoatsand51goatsMaTou.NopolymorphismwasdetectedinMaTaugoats.TwogenotypesAA，GGwerefoundinBoergoats.ThefrequencyofAAgenotypewashigherthanGGgenotype，whichwere0.554and0.446，respectively.TheallelefrequenciesforAandGwere0.554and0.446.TheresultsoftraitsassociationanalysisshowedthatindividualswithAAgenotypehadadditional0.07averagelittersizeatfirstkiddinginBoerGoat.Theadditiveeffectvaluewas0.035，whilethedominanteffectsvalue-1.42.Moreover，AAgenotypehadadditional0.09averagelittersizeformultiparity，theadditiveanddominanteffectsvaluewere0.046and-1.84，respectively.AlleleAwaspossiblelypositivelycorrelatedwithlittersizeinBoergoats.Theadditiveeffectwasdominantatthesite.

Keywords:

Goat；

Reproductivetraits；

MTNR1A；

PCR-RFLP

前言

褪黑激素主要是由松果体合成的，其它合成部位还有:

视网膜、眼眶腔的副泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞，松果体把对外界光照形成的神经信息经下丘脑视交叉上核转变成体液信息—MEL。

1.褪黑激素生理功能、作用机制；

褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜，然后通过视网膜-下视丘至视交叉上核，再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节，其节后交感神经作用于松果体。

松果体分泌褪黑激素，通过下丘脑—垂体性腺轴影响生殖系统。

褪黑激素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现出抑制、促进或无作用的多重性（焦传珍，2005）。

多项研究结果表明，褪黑激素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用，但是对绵羊、山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。

2．褪黑激素受体类型、作用机制；

褪黑激素受体属于G蛋白耦联受体家族。

根据其分子生物学方法又可分为MTNR1A、MTNR1B、MTNR1C三种亚型（张凯等，2006）。

目前在哺乳动物中还没有发现MTNR1C受体，而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现MTNR1A受体，提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。

3．褪黑激素受体分子标记在其它动物中的研究进展

目前国内外对绵羊MTNR1A基因已经有所研究已经很多了。

Messer等（1997）和Notter等（2003）用MnlⅠ和RsaⅠ酶分别对白面杂种羊、萨福克羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体MTNR1A基因外显子2的824bp扩增产物进行消化，发现MnlⅠ在5个绵羊群体中都存在286bp和236bp多态片段，RsaⅠ都存在295bp和290bp多态片段。

Pelletier等（2000）用MnlⅠ限制性内切酶消化2组发情行为有明显差异（常年发情和季节性发情）的Merinosd′Arles母绵羊以及季节性发情明显的Ile2de2France母绵羊MTNR1A基因外显子2的824bp扩增产物，发现存在303bp和236bp多态片段。

季从亮等（2003）和Chu等（2003）用MnlⅠ和RsaⅠ对常年发情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共146只绵羊MTNR1A基因外显子2的824bp扩增产物进行PCR-RFLP多态性分析，发现MnlⅠ在4个绵羊品种中都存在303bp和236bp多态片段，RsaⅠ都存在290bp和267bp多态片段。

在绵羊中的研究结果表明，该基因对绵羊繁殖性能存在影响。

但是，对于山羊，只有对产绒或营养调控的研究，目前尚未发现有对山羊繁殖性能影响的相关报道。

4．本实验目的意义

本实验室滑国华等（2006）在山羊MTNR1A中共发现7个SNPs，对其中4个SNPs分析结果显示：

MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。

为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响，本试验选取G493A突变位点，采用引入酶切位点方法，即限制性片段长度多态性ForcedPCR-RFLP（PolymeraseChainReaction-RestrictionFragmentLengthPolymorphsim），分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况，并分析该位点对波尔山羊产羔数影响，为山羊标记辅助选择提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物

马头山羊51头，采自湖北省十堰市；

波尔山羊65头，采自湖北省宜都市波尔山羊种羊场。

颈静脉采血10ml/只，EDTA抗凝，-20℃保存。

1.1.2实验材料

1.5mlEppendorf管、双面板、微量移液枪（1000μl、200μl、40μl、10μl、2.5μl）及枪头、一次性PE塑料手套。

1.1.3主要试剂的来源

TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；

DNA限制性内切酶HinfⅠ购自晶美生物工程有限公司；

分子量标准100bpDNALadder和PBR322DNA/MspI购自上海生工生物工程技术有限公司；

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲酰胺、丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）、N－N’－亚甲基丙烯酰胺（Bisacrylamide）、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐（EDTANa2）等均购自武汉凌飞科技有限公司。

1.1.4主要仪器设备

表1主要仪器设备

Table1Laboratoryequipmentandinstruments

仪器设备名称

型号

生产厂家

电热恒温水浴锅

GD120

英国Grant公司

台式离心机

TGL-16G

上海安亭科学仪器厂

梯度PCR仪

T1Thermocyler

德国Biometra公司

冷冻离心机

Centrfuge5810

德国eppendorf公司

恒温摇床

HS80

中国科学院武汉科学仪器厂

自动双重纯水蒸馏器

SZ-93

上海亚荣生化仪器厂

紫外分析仪

UV-IV

北京市新科技应用研究所

电泳槽

DYY-

北京六一仪器厂

稳压稳流电泳议

DYY-2

手提式高压灭菌锅

YXQ-SG46-280A

上海博讯实业有限公司医疗设备厂

超纯水仪

WaterPro

美国LABCONCO公司

移液器

1ml；

200μl；

40μl；

10μl；

2.5μl

芬兰Labsystems公司

1.1.5主要试剂的配置

1.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制

1）1MTris.cl储备液：

称取121.4gTris碱溶于800ml双蒸水中，加浓盐酸调至pH=8.0，定容到1000ml。

高压灭菌，室温保存；

2）0.5MEDTA（pH=8.0）：

称取186.1gNa2EDTA·

2H2O溶于800ml双蒸水中，加入NaOH（约20g）调至pH=8.0，定容到1000ml。

3）10%SDS：

称取50gSDS加热溶于400ml双蒸水中，定容至500ml。

4）抗凝剂（0.2MEDTA）：

量取200ml0.5MEDTA加入双蒸水定容至500ml。

1.1.5.2用于基因组DNA提取的溶液的配制

1）蛋白酶K：

称取200mg蛋白酶K溶于10ml双蒸水，以1ml分装，-20℃冷冻保存；

2）氯仿/异戊醇（24:

1）：

量取480ml氯仿，加入20ml异戊醇，混匀；

3）3MNaAc：

称取NaAc·

3H2O溶于400ml双蒸水中，用HAc调至pH=5.2，加水定容至500ml。

4）TE缓冲液：

100mMTris·

cl（pH＝8.0），1mMEDTA（pH＝8.0）。

1.1.5.3用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制

1）50×

TAE储备液：

称取242gTris碱溶于750ml双蒸水中，加入57.1mlHAc、100ml0.5MEDTA（pH＝8.0），加水定容至1000ml；

2）5×

TBE储备液：

称取54gTris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中，加入20ml0.5MEDTA（pH＝8.0），加水定容至1000ml；

3）6×

上样缓冲液：

0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青，15%Ficoll聚蔗糖；

4）溴化乙锭（EB，10mg/ml）:

100ml双蒸水中加入0.1gEB，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，锡箔包裹。

1.1.5.4用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制

1）30%丙烯酰胺（丙烯酰胺:

甲叉双丙烯酰胺＝29:

1）:

700ml双蒸水中加入290g丙烯酰胺，10g甲叉双丙烯酰胺，搅拌使完全溶解，加水定容至1000ml，4℃保存；

2）10%过硫酸铵：

称取1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水，定容至10ml；

3）10%乙醇：

量取50ml无水乙醇溶于450ml水中，混匀；

4）1%HNO3：

量取15ml浓HNO3溶于985ml双蒸水中，混匀；

5）0.2%AgNO3：

称取1gAgNO3溶于500ml双蒸水中，置于棕色试剂瓶；

6）3%Na2CO3（0.05%甲醛）：

称取30g无水Na2CO3溶于900ml双蒸水中，加入1.5ml甲醛，定容至1000ml；

7）3%HAc：

量取30ml冰HAc溶于970ml双蒸水，混匀。

1.2方法

1.2.1.山羊基因组DNA的提取

从山羊颈静脉采血10ml，放入装有抗凝剂（0.5mol/LEDTANa2）的离心管中，6000r/min离心15min，弃上清，吸取白细胞沉淀（参杂少量红细胞）于另一离心管中；

加入两倍体积双蒸馏水（灭菌），摇匀沉淀，静置10min～15min，破碎红细胞；

6000r/min离心15min，轻轻弃去上清，留白细胞沉淀；

加入1×

SET5ml，蛋白酶K（10mg/ml）0.1ml至终浓度200ng/ml，10%SDS250μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜；

加入等体积饱和平衡酚轻轻摇匀，12000r/min离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下相苯酚；

重复上步；

加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1），轻轻摇动10min，12000r/min离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层有机相；

加入等体积氯仿/异戊醇（24:

加入两倍体积预冷无水乙醇，轻轻转动管子，DNA呈絮状析出，用1ml吸头（灭菌）吸出DNA沉淀，放入1.5ml离心管中，加入预冷无水乙醇洗涤一次，离心弃去无水乙醇，再用75%乙醇漂洗2次，小心吸去乙醇，待DNA沉淀自然干燥后，加入适量TE（100μl～300μl）溶解。

1.2.2.引物设计及其序列

引物参考滑国华等（2008）进行设计，序列如下：

上游引物:

5’ACGACCCGAGGATCTATTCC3’

下游引物:

5’ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGATT3’，

在下游引物中引入错配碱基A，当突变位点为G（即反义链为C）时，可形成HinfⅠ（GATTC）酶切位点；

当突变位点为A（即反义链为T）时，该酶切位点缺失，由此可进行基因型判定。

1.2.3.PCR扩增及其电泳检测

1.2.3.1PCR扩增反应体系（表2）

表2PCR扩增反应体系（20μl）

Table2PCRamplificationoftheresponsesystem（20μl）

反应体系

responsesystem

反应体积V（μl）

responsevolume（μl）

灭菌蒸馏水

14.6

10×

Buffer

2

Mg2+

1.2

dNTP

0.2

上游引物

0.4

下游引物

TaqDNA聚合酶（5U/ml）

模板DNA

1

Total

20

1.2.3.2退火温度的优化

利用PCR机器上都有一个Gradient功能，在一次PCR过程中，对机器中不同位点的反应采用不同的退火温度，一般在第一次实验中，采用引物溶点上下10度设置退火温度梯度。

每个温度梯度一个反应，最后电泳检测并比较各个退火温度的条带效果，得到最好结果。

本试验中退火温度设定为55－65℃，结果表明，退火温度60℃时，无非特异性带，目的条带最为清晰。

1.2.3.3PCR反应程序（表3）

表3PCR反应程序

Table3PCRamplificationoftheresponseterm

步骤

steps

PCR反应条件

PCRreactionconditions

温度

temperature

时间

time

预变性

95℃

5min

2C

变性

30sec

3C

退火

60℃

4C

延伸

72℃

5

7min

6

保温

16℃

10min

第二步至第四步循环35次。

1.2.3.4琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，利用BIORAD凝胶成相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。

1.2.3.4.1琼脂糖凝胶电泳方法

（1）灌胶

将透明胶带粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。

放入梳子。

将模放于水平台上。

取一烧杯，放入：

琼脂糖0.75g；

1×

TAE50ml。

混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。

待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。

用吸头吸去表面小泡。

待冷却成胶。

（2）上样电泳

轻轻拔出梳子，将胶两头的透明胶带揭去，移入电泳槽，点样孔一侧靠近操作者，注入1×

TAE缓冲液，浸没凝胶。

使用微量可调采样器取3μlDNA充分混匀于适量溴酚兰，点样于1.5％琼脂糖凝胶孔内，并点3μl600bpMarkerⅠ作为参照。

点样时，加样头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。

使比重较大的样品自然沉入上样孔底。

接上电源：

阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。

开启电源，电压调至100V。

20～30min后检查。

1.2.3.4.2成像分析

利用BIORAD凝胶成相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。

1.2.4.限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测

1.2.4.1酶切反应体系（表4）

表4酶切反应体系

Table4PCRandtheamountofthecomponents

responsevolume（μl）

4.7

HinfⅠ限制性内切酶

0.3

PCR产物

4

10

将上述酶切体系置37℃水浴锅或恒温箱中酶切过夜。

1.2.4.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

1.2.4.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

不同的实验需要优化聚丙烯酞胺凝胶的交联度和浓度，才能达到最好的实验效果，本实验采取一下方法：

1.在小烧杯中加入18.43m1双蒸水，9.33ml30%丙烯酞胺（29:

1），7ml的5×

TBE混匀；

2.清洗制胶用玻璃板，烘干后用透明胶封好底边和侧边，固定在制胶用的有机玻璃板上；

3.向小烧杯中加入245ul的10%AP，13ulTEMED混匀后迅速灌胶；

4.当胶灌至离玻璃板上边缘0.5cm时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不要有气泡，室温聚合1小时；

5.凝胶聚合好后，拔出梳子，注射器吸出梳齿孔中未聚合的液体；

6.取下玻璃板，撕下胶线，固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液1×

TBE；

7.在PCR产物中加入1/6体积上样缓冲液，用微量进样器取5u1酶切样点样，同时点分子量标记物PBR322/Mspl；

8.上样完毕后，打开电泳议以80V电泳20min，再调到120V电泳4～5h。

1.2.4.2.2聚丙烯酰胺凝胶染色步骤

1.拆下电泳装置，剥下聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用双蒸水冲漂洗2次；

2.加入500ml10％乙醇固定液，在摇床上固定8～10min，弃去反应液；

3.加入500ml1％HNO3氧化，在摇床上轻摇8～10min，弃去反应液，用双蒸水漂洗2次；

4.倒入500ml0.2％AgNO3银染液，染色15～30min，弃去反应液，用双蒸水漂洗2次；

5.加入500ml3％Na2CO3显色液，手摇显色至出现清晰的银染带，迅速弃去反应液；

6.用500ml3％HAC停止显色；

7.将已经染好的聚丙烯酰胺凝胶置于透射白光板上，观察酶切反应结果、记录并拍照。

1.2.5.统计分析

基因频率与基因型频率使用软件SPSS10.0进行统计分析，不同基因型对产羔数的最小二乘均值分析使用SAS（8.0版）GLM（GeneralLinearModel）软件包进行，模型如下：

Yijkl=μ+Gi+Pi+eijk

Yijkl为产羔数，μ为群体均值，Gi为基因型效应，Pi为胎次效应，eijk为随机效应。

基因效应分析：

加性效应=（GG-AA）/2

显性效应=AG-（AA+GG）/2

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

扩增波尔山羊和马头山羊基因组，产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的片段与预期片断大小一致（197bp），条带清晰（图1），特异性高，满足后续分析要求。

图1PCR扩增结果

注：

M，MarherⅠ100bpDNALadder；

1、2、3为波尔山羊DNA扩增产物；

4、5、6为马头山羊DNA扩增产物

Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRproduct.

M，1-3，4-6:

100bpDNALadder，PCRproductof?

goat，PCRproductof?

goat

2.2酶切结果

利用限制性内切酶HinfⅠ对PCR扩增产物进行酶切，使用8%的聚丙烯酰胺凝胶（29：

1）电泳检测酶切产物。

在197bp的扩增片段在118bp处存在另一HinfⅠ酶切位点，酶切后产生118bp和79bp片段，其中波尔山羊在118处的酶切位点存在多态性，酶切位点的存在与缺失产生2种基因型，分别命名为AA和G