酶动力学.docx

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酶动力学

6－3－3可逆抑制作用及其动力学

   可逆性抑制剂与酶的结合以解离平衡为基础，属非共价结合，可通过透析等物理方法除去抑制剂、减轻或清除抑制之后，酶活性可以恢复。

   酶促反应中，当有抑制剂时，其一般反应机制可用如下模式表示：

   右式中I为抑制剂，EI为酶－抑制剂复合物，ESI为酶－抑制剂－底物三元复合物，Ks、Ki、Ki'分别为相应的中间复合物的解离常数。

   根据米氏方程的推导方法，令Ks=Km，并有。

v1=K2[E0]可推导出可逆抑制作用速度方程的一般表达式：

并可由此推导出竞争、非竞争、反竞争抑制的速度方程式。

6－3－3－1竞争性抑制作用

   竞争性抑制作用（Competitiveinhibition）是最简单的模型，由于抑制剂I与底物S结构相似因此可竞争性结合于酶活性中心同一结合部位，而且是非此即彼完全排斥。

此类抑制中，酶不能同时和S又和I结合，即不能形成ESI三元复合物。

   1．速度方程由于不能形成ESI三元复合物，即有Ki'=∞，上述一般方程式可改写为：

   速度方程的双倒数方程为：

   2．动力学图（图6－9）

图6－9竞争性抑制动力学图（a）S对v作图

图6－9竞争性抑制动力学图（b）Lineweaver-Buck双倒数作图

   由图6－9可见，当固定不同抑制剂浓度时，以1/v对1/[S]作图，各直线交纵轴于一点，说明Vmax不变，直线与横轴交点右移，说明竞争性抑制时，随I浓度增加，Km数值增大了（1+[I]/Ki）倍。

   例题6－2某消化酶Km=2.92×10-4mol·L-1，[S]=1.5×10-3mol·L-1，当其竞争性抑制剂浓度[I]=3.7×10-4mol·L-1时，可产生75％的抑制作用。

试计算：

a.Ki值？

b.使反应速度恢复到无抑制剂时的水平，底物浓度必须增加到多少？

解：

a.在有竞争性制剂存在下相对活性a=Vi/V0

或

抑制强度：

整理得：

计算得：

Ki=1.99×10-5mol·L-1

b.要使反应速度恢复到无抑制剂水平，则有v=v1。

无抑制时反应速度为：

有抑制时反应速度为：

计算得：

[S]=2.93×10-2mol·L-1

6－3－3－2非竞争性抑制作用

   非竞争性抑制作用（Noncompetitiveinhibition）中，S和I与酶结合互不相关，即无竞争性，也无先后次序，两者都可以与酶及相应中间复合物（EI或ES）结合，但形成三元复合物（ESI或EIS相同）不能再分解。

1.速度方程

当Ki=Ki'时则有

双倒数方程为：

   2．动力学图（图6－10）

图6－10非竞争性抑制动力学图（a）S对v作图

图6－10非竞争性抑制动力学图（b）Lineweaver-Burk双倒数作图

   由图6－10可见，各直线在横轴交于一点，说明非竞争性抑制对反应速度Vmax影响最大，而不改变Km，[I]越大或Ki越小，则抑制因子（1+[I]/Ki）越大，对反应抑制能力越大。

非竞争性抑制在生物体内大多表现为代谢中间产物反馈调控酶的活性。

例题6－3胰蛋白酶的某种非竞争性抑制剂在浓度为2.0×10-4mol·L-1时，对水解反应的抑制程度为75％求Ki？

解：

在非竞争性抑制剂存在条件下。

相对活性

抑制强度：

则有：

求解得：

Ki=6.66×10-5mol·L-1

6－3－3－3反竞争性抑制作用

   反竞争性抑制作用（Uncompetitiveinbihition）中，I只能与ES结合形成无活性三元复合物ESI，而不能与游离酶E结合。

这种情况与竞争性抑制相反，故称为反竞争性抑制。

   1．速度方程由于I不能与游离酶E结合，因此Ki=∞，一般反应方程式可改写为：

   双倒数方程为：

图6－11反竞争性抑制动力学图（a）S对v作图

图6－11反竞争性抑制动力学图（b）Lineweaver-Burk双倒数作图

   从图6－11可看出，无论在纵轴上或横轴上，随[I]变化，截距均发生变化，而斜率Vmax/Km不变，随[I]增加，Vmax和Km均降低了（1+[I]/Ki）倍，反竞争性抑制在简单系统中少见，但在多元反应系统中是常见的动力学模型。

6－3－3－4混合性抑制作用

   在一般动力学方程中，Ki≠Ki'时，即E或ES结合I的亲和力，以及E或EI结合S的亲和力都不相当时，就是混合性抑制，当Ki>Ki'时表现为非竟争与竟争性抑制的混合，而Ki

   1．速度方程混合性抑制方程，实际上就是一般速度方程表达式：

   2．动力学图（图6－12）

   由图6－12可见，当有抑制剂I存在时，Vmax均减小，Km则可大可小，在Vmax和Km均减小情况下，Vmax减小甚于Km减小，故Km/Vmax增大，抑制强度与[I]成正比，与[S]成正比（Ki>Ki'）或反比（Ki

图6－12混合性抑制动力学图 （a）Ki>Ki'

图6－12混合性抑制动力学图 （b）Ki

四种抑制类型比较如下：

表6－2四种抑制类型的动力学比较

抑制类型

表观Km（）

表观Vmax（）

无抑制剂

Km

Vmax

竞争性

Km增大

Vmax不变

反竞争性

Km减小

Vmax减小

非竞争性

Km不变

Vmax减小

非竞争性与反竞争性混合

Km减小

Vmax减小

非竞争性与竞争性混合

Km增大

Vmax减小

6－3－3－5可逆性抑制作用的应用

   1．磺胺类药物与抗菌增效剂多数病原菌在生长时不能利用现成的叶酸，而只能利用对氨基苯甲酸台成二氢叶酸（DHF），后者再转化成四氢叶酸（THF），参与核酸合成。

   磺胺类药物设计的结构由于和对氨基苯甲酸相似，因此可竞争性结合细菌的二氢叶酸合成酶，从而抑制了细菌生长所必需的二氢叶酸合成，使细菌核酸合成受阻，从而抑制了细菌的生长和繁殖。

而动物和人能从食物中直接利用叶酸，故其代谢不受磺胺影响。

磺胺药                 对氨基苯甲酸（PABA）

   抗菌增效剂三甲氧苄二氨嘧啶（TMP）可增强磺胺药的药效。

其结构与二氢叶酸有类似之处，是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，但很少抑制人和动物的二氢叶酸还原酶。

它与磺胺药配合使用，可使细菌的四氢叶酸合成受到双重阻断作用，因而严重影响细菌的核酸及蛋白质的生物合成，达到抑菌目的。

   2．叶酸类似物叶酸类似物主要是蝶呤环上C4羟基被氨基取代或N10上的氢原子被甲基取代，如氨基蝶呤、氯甲蝶呤（见下结构式），这类4－氨基衍生物的2，4－二氨基嘧啶部分能与四氢叶酸合成酶形成更多的氢键。

另外，由于4－氨基存在，增加了化合物的碱性，在生理pH下，质子化后易与酶活性中心上的阴离子结合，因此对酶的亲和力大于叶酸。

它们可竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸还原成二氢叶酸和四氢叶酸，从而阻断嘌呤核苷酸合成而抑制癌细胞生长。

   3．嘌呤类似物腺嘌呤、鸟嘌呤是DNA、RNA主要成分，次黄嘌呤是嘌呤碱合成的重要中间体。

嘌呤类似物主要是次黄嘌呤和鸟嘌呤的衍生物。

如6－巯基嘌呤（6－MP）和溶癌呤，它们在体内首先转化成有活性的6－巯基嘌呤核苷酸，抑制腺嘌呤琥珀酸合成酶，阻止次黄嘌呤核苷酸（IMP）转化成AMP，从而达到干扰癌细胞核苷酸及蛋白质合成的目的。

   4．嘧啶类似物与嘌呤类似物的作用相似，嘧啶类似物也主要是通过竞争性抑制作用妨碍癌细胞DNA生成。

已设计的抗癌药物如5-氟尿嘧啶（5-Fu），由于氟的原子半径与氢原子半径相似，氟化物体积与原化合物几乎相等，加之C-F键的稳定性，特别是在代谢中不易分解，能在分子水平代替正常代谢物，欺骗性地进入生物大分子中而导致"致死合成"。

5-氟尿嘧啶在体内转变为5-氟尿嘧啶核苷（5-FUR）再进一步形成5-氟尿嘧啶核苷酸（5－FURP）和5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（d-5FUDRP）（图6－13）挤人DNA。

但5－FU抗癌的主要作用，是由于d-5FUDRP是尿嘧啶脱氧核苷酸类似物，可竞争性抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶。

该酶的正常作用是将尿嘧啶脱氧核苷酸转变成胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

由于该酶受到抑制，尿嘧啶脱氧核苷酸不能进行甲基化形成胸腺嘧啶脱氧核苷酸，从而影响癌细胞DNA合成。

   5．氨基酸类似物氨基酸类似物如重氮丝氨酸和6-重氮-5-氧正亮氨酸，它们的化学结构与谷氨酸相似，这些药物与天然谷氨酸可竞争结合氨基转移酶类，从而抑制嘌呤核苷酸合成。

   有些化合物虽然其平面结构与底物类似处不多，但立体结构与底物十分相似（图6－14）。

也可作为竞争性抑制剂，如青霉素抑制革兰氏阳性菌的糖肽转肽酶（Glycopeptidetranspeptidase）的作用。

革兰氏阳性菌的胞壁以肽聚糖为主要成分，肽聚糖是由多糖链与肽链交叉联结的网状结构物质。

青霉素在立体结构上与转肽酶底物，肽聚精链中的D-丙氨酰-D-丙氨酸的相似故能竟争性地与转肽酶结合，抑制甘氨酸与丙氨酸的交联，从而阻断肽聚糖的合成（图8-15）。

图6－14青霉素和肽聚酶链末端D-Ala-D-Ala立体模型结构

   中左箭头指青霉素β-内酰胺环的CO-NH键部位；中右箭头指肽聚糖链D-Ala-D-Ala的CO-NH键部位。

图6－15青霉素竞争性抑制作用

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