Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定Word下载.docx

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RNAinterfering;

HCT116cellline

Stat3是信号传导及转录活化因子家族（signaltransducersandactivatorsoftranscription,Stats）的重要成员。

研究表明Stat3可通过抑制凋亡或诱导细胞增生参与肿瘤的发生和发展，在癌细胞中有高度的活性［1］。

Stat3能编码凋亡抑制剂和细胞周期调节剂，通过上调BclXl、Mcl1、cyclinsD1/D2和cmyc基因的作用参与肿瘤的形成［2］。

有研究显示，Stat3异常激活与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关［3-4］。

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指由双链RNA（doublestrandedRNA,dsRNA）引发的转录后基因沉默机制，RNAi能够高效特异地沉默同源基因的表达。

1998年RNAi的发现［5］，特别是在哺乳动物细胞应用小干扰RNA（smallinterfering，siRNA）成功介导RNAi［6］，为基因功能的研究提供了强大的武器，也为肿瘤基因治疗增添了新的活力。

本实验拟构建以Stat3基因为靶向的RNA干扰重组体，通过RNAi技术沉默Stat3基因的表达来探索肿瘤基因治疗的新方法。

1材料与方法

　材料

真核表达载体为质粒Pavu6＋27（由美国Michigan大学生物化学系DavidEngelke博士惠赠），克隆用大肠杆菌JM109（由第三军医大学中心实验室保存）,HCT116细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

限制性内切酶SalⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ，T4DNA连接酶，RTPCR试剂盒均为大连TaKara生物公司产品；

电泳Mark选用DL2000核酸分子量标准、柱离心式质粒抽提试剂盒、柱离心式胶回收试剂盒均购自美国Promega公司；

DOTAP脂质体转染试剂、RNA提取试剂Tripure、DEPC购自美国Roche公司；

DMEM高糖培养基、标准小牛血清购自美国Hyclone公司。

吕伟，等.Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定　方法

　siRNA表达载体的构建和鉴定根据NCBI提供的人类Stat3基因结构（GeneID:

6774），以及siRNA设计的技术要求，用“siRNASequenceSelector”（）设计针对Stat3特异的siRNA序列（19nt）：

TGCATAGGACGGAATGAAC，以BLAST分析所设计序列的特异性。

构建siRNA表达载体的模板序列为：

5‘TCGACTGCATAGGACGGAATGAACAAGCGTTCATTCCGTCCTATGCATTTTTT3‘；

5‘CTAGAAAAAATGCATAGGACGGAATGAACGCTTGTTCATTCCGTCCTATGCAG3‘。

寡核苷酸链由上海生物工程技术公司合成，核苷酸链在退火缓冲液中退火后,与SalⅠ，XbaⅠ双酶切的线性化Pavu6＋27载体连接，连接产物转化感受态细菌JM109，挑选单菌落，筛选重组体，重组体命名为：

Pavu6＋27Stat3（图1）。

重组体质粒用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切核酸酶进行双酶切，阳性克隆送上海生工生物公司检测核苷酸序列。

图1构建重组表达载体技术路线图

　细胞培养及转染细胞培养于含10%灭活小牛血清、1×

105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养液中，于37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹经灭菌处理的重组质粒（质粒∶脂质体=1∶6）。

转染前1d，换取新鲜培养液（含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，37℃，体积分数为5%CO2孵箱中培养）后调整浓度为2×

105/ml，以每孔2ml接种于6孔培养板中培养，待细胞增至60%～80%时，将质粒脂质体复合物转染至细胞中，18h后弃去转染液，换新鲜培养液继续培养，弃去原培养液，用含G418300μg/ml的DMEM培养液进行筛选收集G418抗性细胞。

转染了Pavu6＋27Stat3siRNA的HCT116细胞简写成Pavu6＋27Stat3siRNAHCT116细胞。

转染空质粒的Pavu6＋27的HCT116细胞简写成Pavu6＋27HCT116作为对照。

　半定量RTPCR法检测Stat3mRNA表达［7］Pavu6＋27Stat3siRNAHCT116细胞中Stat3mRNA表达改变，以Pavu6＋27HCT116为对照。

收集培养的2种细胞分为4组,按Tripure操作说明，分别提取总RNA，紫外分光光度计定量，调整浓度为1g/L。

取2μlTotalRNA与1μlOligo（dT）70℃5min，置于冰浴5min，加2μl10mmol/LdNTP混合，5μl5×

Buffer，1μlMMLV反转录酶，1μlRNAsin，去离子水补至25μl。

42℃60min，-20℃冻存。

PCR反应体系为：

2μl反转录产物（模板），两对引物各1μl（选用看家基因甘油醛3磷酸脱氢酶GAPDH基因作为内参照，GAPDH上游引物的序列为5‘AATTCAACGGCACAGTCAAGGC3‘，下游引物的序列为5‘GGATGCAGGGATGATGTTCTGG3‘，扩增片段为467bp。

Stat3上游引物序列为5‘GTCAGATGCCAAATGC3‘，下游引物的序列为5‘CCTGGAGGCTTAGTGC3‘，扩增片断长度386bp，引物序列设计合成均由大连Takara公司完成）。

μl10×

Buffer，2μl25mmol/LMgCl2，2μl10mmol/LdNTP混合，μlTaq酶，去离子水补至25μl。

反应条件为：

预变性94℃5min；

94℃1min，60℃50s，72℃1min共30个循环；

72℃延伸10min。

取10μl产物2%琼脂糖凝胶电泳，对照分子量标准检测扩增结果，GelDoc2000型凝胶成像分析系统对目的DNA条带进扫描，用Imageglub分析软件测得电泳图谱上每条基因条带的光密度值。

计算各个样本Stat3强度与GAPDH内对照强度的比值，从而反映Stat3表达的变化。

用t检验对所得结果进行统计学处理，以为差异有统计学意义。

　　2结果

　重组质粒酶切鉴定

Pavu6＋27Stat3重组体质粒经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后呈3条带，分别为kb的载体片段、348bp和397bp的小片段。

空载体双酶切后出现两条带，kb的载体片段，348bp和353bp不能分开，融为一条带（图2）。

　重组质粒测序鉴定

将重组质粒Pavu6＋27Stat3送上海生工测序，引物序列根据Pavu6＋27载体序列，采用Primer设计为：

5‘CCCAAGCTTGGATCCAAGGTCGGGC3‘。

结果表明siRNA表达模板成功构建于Pavu6＋27载体上，序列完全正确（286～338）与目的序列相同。

　半定量RTPCR结果

Stat3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后，结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致，分别为386bp和467bp，为电泳染色后结果，1～4泳道为对照，5～8泳道为实验组。

可见,重组体Pavu6＋27Stat3siRNA转染的HCT116中Stat3mRNA的表达较空载体Pavu6＋27转染的HCT116细胞中Stat3mRNA表达量显着下降（图3A）。

统计分析结果表明，重组体Pavu6＋27Stat3siRNA转染的HCT116中Stat3mRNA的表达较空载体Pavu6＋27转染的HCT116细胞中Stat3mRNA表达量显着下降。

Stat3mRNA扩增产物的强度与内对照GAPDH的比值在对照组和实验组分别为±

和±

，实验组约降低为对照组的%（,n=4）（图3B）。

3讨论

Stat3信号传导通路接受生长因子、细胞因子等细胞外信号刺激，通过借助细胞内的一类具有激酶结构的连接蛋白JAKs（janusKinase）磷酸化而被激活从而完成信息转导。

研究表明多种与肿瘤增殖凋亡相关的细胞因子如：

生长激素（GH）、干扰素（IFN）、白细胞介素（IL2、IL6）等都通过JAKsStat通路最终影响基因的转录调节［8］。

在此通路中Stat3单体通过SH2结构域与另一个Stat3分子磷酸化的酪氨酸残基相互作用形成二聚体进入细胞核内与特异的DNA片段结合，调控靶基因转录，影响细胞的增殖、分化和凋亡。

如能设法阻断癌细胞内Stat3基因的表达，定会大大减弱癌细胞增殖能力同时减弱凋亡抑制。

阐明Stat3在肿瘤细胞凋亡抑制和增殖中的作用，可为肿瘤治疗提供新的靶点，具有重要的理论意义和实际应用前景。

近几年来兴起的RNA干扰技术，尤其是siRNA为肿瘤的生物治疗开辟了新的途径［9］。

与传统基因沉默技术相比，具有效果强、持续时间长、技术流程简便、短周期，在细胞内表达的稳定性、可传递性、高效性等优势已经使这一技术在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景［6］。

实验采用的载体pAVU6+27属于采用U6启动子的质粒载体，被证实是具有良好siRNA表达效率的载体。

文献报道，该载体能诱发高达80%～90%的基因沉默效率［10］。

本实验已经成功构建了阻断Stat3基因表达的RNAi序列，并已克隆至载体Pavu6＋27中，经酶切和DNA测序鉴定完全正确。

采用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞株后获得了siRNA的表达，经RTPCR检测发现实验组Stat3mRNA表达抑制率为%，明显低于空质粒转染组，提示重组载体通过RNAi有效阻断Stat3基因的表达，从而为下一步的利用重组载体进行肿瘤治疗的实验研究打好了基础。

【参考文献】

［1］BuettnerR,MoraLB,JoveR.ActivatedStatsignalinginhumantumorsprovidesnovelmoleculartargetsfortherapeuticintervention［J］.ClinCancerRes,2002,8（4）:

945-954.

［2］MoraLB,BuettnerR,SeigneJ,etal.ConstitutiveactivationofStat3inhumanprostatetumorsandcelllines:

directinhibitionofStat3signalinginducesapoptosisofprostatecancercells［J］.CancerRes,2002,62（22）:

6659-6666.

［3］BowmanT,GarciaR,TurksonJ,etal.Statsinoncogenesis［J］.Oncogene,2000,19（21）:

2474-2488.

［4］TrovatoM,VitarelliE,GrossoM,etal.ImmunohistochemicalexpressionofHGF,cMETandtranscriptionfactorStat3incolorectaltumors［J］.EurJHistochem,2004,48（3）:

291-298.

［5］FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.PotentandspecificgeneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditiselegans［J］.Natrue,1998,391（6669）:

744-745.

［6］ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells［J］.Nature,2001,411（6836）:

494-498.

［7］奥斯伯F，布伦特R,金斯顿RE,等.精编分子生物学实验指南［M］.北京：

科学出版社，1998.

［8］AhmedChoudhuryJ,WilliamsKT,YoungLS,etal.CD40mediatedhumancholangiocyteapoptosisrequiresJAK2dependentactivationofStat3inadditiontoactivationofJNK1/2andERK1/2［J］.CellSignal,2006,18（4）:

456-468.

［9］WidaM,FuchsU,WossmannW,etal.KillingofleukemiccellswithaBCR/ABLfusiongenebyRNAinterference（RNAi）［J］.Oncogene,2002,21（37）:

5716-5724.

［10］PaulCP,GoodPD,WinerI,etal.EffectiveexpdressionofsmallinterferingRNAinhumancells［J］.NatBiotechnol,2002,20（5）:

505-508.