抗氧化功能检验方法Word文件下载.docx

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1.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。

受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.3实验方法

1.3.1老龄动物

选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。

3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

1.3.2D－半乳糖氧化损伤模型

1.3.2.1原理

D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。

1.3.2.2造模方法

选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kgBW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。

随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

1.3.3乙醇氧化损伤模型

1.3.3.1原理

乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。

1.3.3.2造模方法

选25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。

3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

1.3.4脂质氧化产物测定

1.3.4.1血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。

1.3.4.1.1荧光法

1.3.4.1.1.1荧光法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。

1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。

以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。

可用荧光法进行微量测定。

1.3.4.1.1.2仪器与试剂

仪器：

荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管

试剂：

10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL

29mmol/L硫代巴比妥酸工作液

硫代巴比妥酸0.209g

EDTA.2H2025mg

谷胱甘肽（还原型）1mg

用0.02mol/LNaOH50mL溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）

酸水解液

0.1mol/LH2SO4125mL

0.1mol/LNa2SO4125mL

加水150mL用H2SO4调pH1.5，加水稀释至500mL

正丁醇

以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选AR级）最好用双蒸水配制。

1.3.4.1.1.3实验步骤

1.3.4.1.1.3.1样品制备

全血上清液：

取血50μl加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。

血清样品：

取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。

1.3.4.1.1.3.2标准曲线制作

将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

1.3.4.1.1.3.3样品测定

试剂

空白管

样本管

标准管

10mL具塞离心管

0.1mL蒸馏水

0.1mL血清*

0.1mL标准＃

2mL

TBA工作液

0.5mL

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却

3mL

振荡抽提1min，3000r/min离心5min

*全血上清液0.5mL（空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL）

＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）

血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

1.3.4.1.1.3.4计算公式：

B-AB-A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝———×

C×

K=————×

1×

1

F-AF-A

B-AB-A1

过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝———×

K=———×

————

F-AF-A0.05

A：

空白管荧光度

B：

样品荧光度

F：

四乙氧基丙烷荧光度

C：

四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）

K：

稀释倍数

1.3.4.1.2比色法

1.3.4.1.2.1比色法原理

该物质在波长532nm有极大吸收峰。

可用分光光法进行测定。

1.3.4.1.2.2仪器与试剂

可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。

0.2M乙酸盐缓冲液pH3.5

0.2M乙酸溶液185mL

0.2M乙酸钠溶液15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL

8.1%十二烷基硫酸钠SDS

0.8%硫代巴比妥酸TBA

0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4

0.2M磷酸氢二钠1920mL

0.2M磷酸二氢钾480mL

1.3.4.1.2.3实验步骤

1.3.4.1.2.3.1样品制备

溶血液样品：

取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2％溶血液。

1.3.4.1.2.3.2样品测定

试剂

样品管

2％溶血液*

0.2mL

40nmol/mL四乙氧基丙烷

8.1%SDS

0.2M乙酸盐缓冲液

1.5mL

0.8%TBA

H2O

0.8mL

0.6mL

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色

注：

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

*若用血清，样品管0.15mL，标准管0.15mL。

1.3.4.1.2.3.3计算

B–AB–A

过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×

K=—————×

40×

F–AF–A

B–AB–A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝————×

A:

空白管吸光度

样品吸光度

四乙氧基丙烷吸光度

四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）

1.3.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

1.3.4.2.1原理

见1.3.4.1.2.1

1.3.4.2.2仪器与试剂

可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器

见1.3.4.1.2.2

1.3.4.2.3实验步骤

1.3.4.2.3.1样品制备

组织匀浆样品：

取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。

1.3.4.2.3.2样品测定

10％组织匀浆

0.7mL

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行

1.3.4.2.3.3计算

B-AB-A1

过氧化脂质含量＝————×

K=———×

————————

（nmol/mg组织）F-AF-A0.2×

10%×

1000

样品管吸光度

1.3.4.3血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定

1.3.4.3.1原理

8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。

1.3.4.3.2仪器与试剂

仪器：

酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机

试剂：

8-IsoprostaneKIAKit（酶联免疫试剂盒）

8-IsoprostaneEIA抗体血清、8-IsoprostaneAChE示踪物、8-IsoprostaneEIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellman’s试剂

1.3.4.3.3实验步骤

1.3.4.3.3.1样品制备

小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。

取上清液，用EIA缓冲液稀释15倍备用。

1.3.4.3.3.2样品测定

按试剂盒说明操作。

8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：

500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12.8pg/mL、5.1pg/mL、2.0pg/mL、0.8pg/mL

步骤

空白

TA

NSB

B0

标准/样品

1.加试剂

EIA缓冲液

-

100μL

50μL

AChE示踪物

抗体血清

2.培养

用封板膜盖好酶标板，并在4℃避光条件下培养18小时

3.清洗

清洗所有反应孔五次

4.加试剂

5μL

Ellman’s

200μL

5.培养

用封板膜盖好酶标板，并在常温避光条件下培养45-90分钟

6.读数

在波长412nm处测量各孔吸光度（B0在0.3-1.0A.U范围）

标准或样品孔吸光度—NSB孔吸光度

%B/B0=——————————————————×

100

B0孔吸光度—NSB孔吸光度

以标准物的浓度的对数（log）为横坐标，%B/B0为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转换成logit（B/B0）或ln[B/B0/（1-B/B0）]做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

将样品的%B/B0值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。

1.3.5蛋白质氧化产物测定

H2O2或O2·

ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。

羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。

羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。

蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。

1.3.5.1血清中蛋白质羰基测定

1.3.5.1.1原理

被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4．二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。

1.3.5.1.2仪器与试剂

紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

10mmol/L2，4-二硝基苯肼（DNPH）

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。

2mol/LHCL

200g/L三氯乙酸（TCA）

6mol/L盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：

1的比例配置成混合溶液，现用现配。

1.3.5.1.3操作步骤

测定管

对照管

血清（血浆）

0.1ml

10mmol/L2，4-二硝基苯肼

0.4ml

2mol/LHCL

涡旋混匀1分钟，37℃准确避光反应30分钟

200g/L三氯乙酸

0.5ml

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

1.0ml

6mol/L盐酸胍

1.25ml

混匀后，37℃准确水浴15分钟

涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6mol/L盐酸胍试剂调零，测定OD值。

用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。

1.3.5.1.4计算公式

测定管OD-对照管OD

蛋白质羰基含量=——————————————————————×

125×

105

（nmol/mgprot）22×

比色光径（cm）×

样本蛋白浓度（mg/L）

1.3.5.2组织中蛋白质羰基测定

1.3.5.2.1原理

见1.3.5.1.1

1.3.5.2.2仪器与试剂

紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

10mmol/LHEPES缓冲液pH7.4

2.38克N-2-羟乙基哌嗪-2’-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml双蒸馏水，用lNNaOH调pH至7.4，4℃保存。

100g/L硫酸链霉素

1g硫酸链霉素，溶入10ml双蒸馏水，4℃避光保存。

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。

2mol/LHCL

200g/L三氯乙酸（TCA）

6mol/L盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：

1.3.5.2.3实验步骤

1.3.5.2.3.1样品处理

取0.1g组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。

加人0.9ml的冰的10mmol/LHEPES缓冲液（pH7.4），制成10％的匀浆。

将匀浆液以3000r/min的转速，离心10min，保留上清。

取100g／L的硫酸链霉素溶液50µ

l，加入上清液450µ

l（v/v,1:

9），室温放置10min后，以11000r/min的转速，离心10min，取上清液待测。

1.3.5.2.3.2操作步骤

组织匀浆上清液

用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。

1.3.5.2.3.3计算公式

1.3.5.3注意事项

1.3.5.3.1加入硫酸链霉素：

在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。

核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，这些碱基就会与DNPH结合，并反应生成有色物质，这些物质会增加最后溶液的吸光度，使结果偏大。

1.3.5.3.2DHPH的溶解：

DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此，用2mol／LHC1来溶解DNPH。

设对照管是为了避免HC1与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。

1.3.5.3.3反应体系应避光：

当蛋白质溶液中加人DNPH进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为DNPH不稳定，见光会分解。

如果反应体系遇到光，DNPH分解，体系中会有剩余的没有变成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。

1.3.5.3.4去除未与蛋白质结合的DNPH：

由于DNPH在370nm左右有强烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH，否则，会增加吸光值。

1.3.6抗氧化酶活力测定

SOD催化超氧阴离子自由基（O2·

ˉ）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2·

ˉ对细胞的毒害作用。

SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。

消除自由基的能力与酶活性成正比。

1.3.6.1血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

1.3.6.1.1原理

O2·

ˉ氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2·

ˉ后形成的亚硝酸盐减少。

1.3.6.1.2仪器与试剂

仪器可见光分光光度计、酶标仪、离心机、恒温水浴、匀浆器

试剂65mM磷酸盐缓冲液（PBS）pH7.8

10mmol/L盐酸羟胺

盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL

7.5mmol/L黄嘌呤

黄嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL

0.2g/L