基因工程原理实验指导Word格式文档下载.docx

基因工程原理实验指导Word格式文档下载.docx

《基因工程原理实验指导Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程原理实验指导Word格式文档下载.docx（30页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

⑨沉淀溶于50μlTE（含RNaseA20μg/ml）,37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用。

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；

蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

一、试剂准备

1.溶液Ⅰ:

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2.溶液Ⅱ：

0.2NNaOH，1%SDS。

2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置。

3.溶液Ⅲ：

醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。

4℃保存备用。

4.TE：

10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。

15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）

6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）

7.5×

TBE：

Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·

2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。

8．溴化乙锭（EB）：

10mg/ml

9.RNaseA（RNA酶A）：

不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10.6×

loadingbuffer（上样缓冲液）：

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

11.1%琼脂糖凝胶：

称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×

TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：

EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×

TBE），即可上样。

二、操作步骤

1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×

1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g×

10min。

7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×

15min。

8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×

7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

9.沉淀溶于20μlTE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

三、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。

这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。

因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA1-2μl，加适当loadingbuffer混匀上样,采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

四、注意事项

本裂解法小量制备质粒DNA重复性好，一般无麻烦。

若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

试验二大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化

实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

实验原理

转化（Transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。

转化中的受体细胞：

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。

转化方法：

电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法

感受态细胞：

处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。

转化细胞（转化子）：

带有异源DNA分子的受体细胞（Transformant）。

本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。

pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。

将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

影响转化率的因素：

细胞生长状态和密度。

转化的质粒DNA的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源DNA的污染。

实验仪器

离心设备

实验试剂：

大肠杆菌DH5α

LB培养基，

0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

氨苄青霉素

pUC18质粒

实验步骤：

菌株活化:

1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时

2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时

3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4

感受态细胞制备:

4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min

5.4000rpm离心5min,弃上清

6.加入0.8ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min

7.4000rpm离心5min,弃上清

8.加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使用。

也可加入总体积15％的甘油可－70℃长期保存

外源DNA的转化:

9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min

10.于42℃水浴90S

11.冰上放置2min

12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时

13.将培养液均匀涂布在含Amp的培养基平板上

14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

对照组

对照组1:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

　　转化子总数＝菌落数×

稀释倍数×

转化反应原液总体积／涂板菌液体积

　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）

　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×

菌液总体积／涂板菌液体积

　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

实验结果

试验三质粒DNA的转化

【原理】

转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。

转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。

将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。

将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。

本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。

其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。

含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。

【试剂与器材】

1．LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。

2．LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

3．0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。

4．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

5．人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS（-）载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体。

因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS（-）载体（2.96kb）和人Bcl-2cDNA片段（1.9kb）。

配制成2g/1μl。

6．大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌

7．恒温水浴箱

8．超净工作台

9．高速冷冻离心机

10．恒温摇床

11．恒温箱

12．消毒离心管

13．消毒tips

14．玻璃培养皿直径90mm

15．玻璃涂布器

16．95%乙醇

17．标记笔

【操作步骤】

1．细菌感受态细胞的制备

将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。

挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。

次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。

将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。

4000×

g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。

加预冷的已过滤除菌的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置冰浴30min。

g，4℃离心10min，弃培养基。

再加4ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。

2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α

本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒。

在无菌条件下按每管取200μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共2管，分别加入人Bcl-2重组质粒（10ng）和消毒水（作阴性对照）各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。

42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以150r/min速度振摇45min，使细菌复苏。

每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。

【注意事项】

1．含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌落平板倒置置于4℃保存，于下周进行质粒DNA的制备。

试验四重组质粒DNA转化大肠杆菌

一、目的

掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。

二、概述

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段（＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

但在实际工作中,如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。

通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

三、材料及试剂

（一）、材料

1.外源DNA片段:

自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知。

2.载体DNA:

pBS质粒（Ampr,lacZ）,自行提取纯化,浓度已知。

3.宿主菌:

E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。

1.设备

2.恒温摇床

3.台式高速离心机

4.恒温水浴锅

5.琼脂糖凝胶电泳装置

6.电热恒温培养箱

7.电泳仪无菌

8.工作台

9.微量移液枪

10.eppendorf管

（二）、试剂

1.LB固体和液体培养基

2.T4DNA连接酶（T4DNAligase）；

购买成品。

3.X-gal储液（20mg/ml）:

用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。

4.IPTG储液（200mg/ml）:

在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

5.含AmpLB固体培养基:

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

6.含X-gal和IPTG的筛选培养基：

在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40ulX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。

7.感受态细胞制备试剂　

四、操作步骤

（一）、连接反应

1.取新的经灭菌处理的0.5mleppendorf管,编号。

2.将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量（可稍多）的外源DNA片段。

3.加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。

将混和物冷却至0℃。

4.加入10×

T4DNAligasebuffer1μl,T4DNAligase0.5μl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。

5.同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；

对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

（二）、E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化

　　每组连接反应混和物各取2μl转化E.coliDH5α感受态细胞。

（三）重组质粒的筛选

1.每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

2.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

3.不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。

带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在LB筛选培养基上呈现为红色菌落。

在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。

带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在LB选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。

（四）、酶切鉴定重组质粒

1.用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp50μg/ml的5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。

2.使用快速分离质粒DNA直接电泳，同时以抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。

3.再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。

4.还可用杂交法筛选重组质粒。

5.PCR法

五、注意事项

1.DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。

2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。

3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。

5.在连接反应中，如不对载体分子进行去5'

磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。

6.LB选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。

该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。

但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。

7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。

IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。

8.在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显

试验五CTAB法提取植物基因组DNA

这种方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。

CTAB（十