基因工程原理实验指导Word格式文档下载.docx

1、沉淀溶于50lTE （含RNaseA 20g/ml） , 37水浴30min 以降解RNA 分子, - 20保存备用。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DN

2、A的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生

3、物学实验室中常用。一、试剂准备1. 溶液: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4。2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。3. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备

4、用。4. TE：10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。8溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶（DNase-free） RNase A的10mg/ml，T

5、E配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20。10. 6loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5g/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5TBE），即可上样。二、操作步骤 1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（

6、含相应抗生素）液体培养基中，37、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4.加200l新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5.加入150l预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉

7、淀。6.加入450l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4离心12000g 10min。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4离心12000g15min。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9.沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用。三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切

8、接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。取制备的质粒DNA 1-2l，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。四、注意事项 本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次

9、抽提，以清除杂质来解决问题。试验二 大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理转化（ Transformation ）是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。转化方法：电击法、 CaCl2、 RuC

10、l等化学试剂法感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞（转化子）：带有异源 DNA 分子的受体细胞（ Transformant ）。本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。影响转化率的因素：细

11、胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。实验仪器 离心设备实验试剂：大肠杆菌DH5LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒 实验步骤：菌株活化:1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2.挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4感受态细胞制备:4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min5.4000rpm离心5min,弃上清6.加入0.8ml预

12、冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5 min,弃上清8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 可70长期保存 外源DNA的转化:9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min10.于42水浴90S11.冰上放置2min12.加入800lLB液体培养基于37培养1小时13.将培养液均匀涂布在含Amp 的培养基平板上14.将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果对照组对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗

13、生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量（mg） 感受态细胞总数对照组菌落数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数实验结果试验三 质粒 DNA 的转化【原理】 转化是将外源 DNA 分子导入到受体

14、细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。本实验采用 CaCl 2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 4 ， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗

15、DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。【试剂与器材】 1 LB 液体培养基 10g

16、 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。2 LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3 0.1mol/L CaCl 2 高压灭菌消毒或过滤除菌。4 氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 保存。5 人 Bcl-2 重组质粒 它是 Eco R 单酶切的 pBluescript KS（-） 载体与 EcoR 单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用 Eco

17、 R 酶切则应到空载 pBluescript KS（-） 载体 （2.96kb） 和人 Bcl-2 cDNA 片段 （1.9kb） 。配制成 2g/1 l 。6 大肠杆菌 DH5 此为 DNA 扩增菌 7 恒温水浴箱 8 超净工作台 9 高速冷冻离心机 10 恒温摇床 11 恒温箱 12 消毒离心管 13 消毒 tips 14 玻璃培养皿 直径 90mm 15 玻璃涂布器 16 95% 乙醇 17 标记笔 【操作步骤】 1 细菌感受态细胞的制备 将 DH5 菌种划线于 LB 琼脂板上， 37 培养过夜。挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中， 37 振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种

18、至含有 100ml LB 培养基的烧瓶中， 37 剧烈振荡培养至约 2 3h ，待 A 600 值达到 0.3 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000 g ， 4 离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl 2 重悬菌体，置冰浴 30min 。 g ， 4 离心 10min ，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl 2 ，轻轻重悬菌体，置 4 冰箱 12 16h 。2 DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 本实验中的 DNA

19、重组子为人 Bcl-2 重组质粒。在无菌条件下按每管取 200 l 新鲜感受态 DH5 细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒 （10ng） 和消毒水 （ 作阴性对照 ） 各 5 l ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。 42 ，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800 l 无抗生素的 LB 培养基，于 37 空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200 l 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸收，然后 37 倒置培

20、养 12 16h 至单菌落形成。【 注意事项 】 1 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 菌落平板倒置置于 4 保存，于下周进行质粒 DNA 的制备。试验四 重组质粒DNA转化大肠杆菌 一、目的 掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。二、 概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分

21、子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如互补现象等来鉴别重组子和非重组子。三、材料及试剂 （一）、材料 1. 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知。2. 载体DNA: pBS质粒（Ampr ,lacZ）,自行提取纯化,浓度已知。3. 宿主菌: E. coli DH5,或JM系列等具有-互补能力的菌株。1. 设备 2. 恒温摇床 3. 台式高速离心机 4. 恒温水浴锅 5. 琼脂糖凝胶电泳装置

22、6. 电热恒温培养箱 7. 电泳仪无菌 8. 工作台 9. 微量移液枪 10. eppendorf管 （二）、试剂 1. LB固体和液体培养基 2. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）；购买成品。3. X-gal储液（20mg/ml）: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。4. IPTG储液（200mg/ml）: 在800l蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20。5. 含AmpLB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷

23、却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。6. 含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50g/ml Amp的LB平板表面加40 ul X-gal储液和4lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。7. 感受态细胞制备试剂 四、操作步骤 （一）、连接反应 1. 取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。2. 将0.1g载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量（可稍多）的外源DNA片段。3. 加蒸馏水至体积为8l,于45保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0。4. 加入10T

24、4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5l, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16保温8-24小时。5. 同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。（二）、E. coli DH5感受态细胞的制备及转化 每组连接反应混和物各取2l转化E. coli DH5感受态细胞。（三） 重组质粒的筛选 1. 每组连接反应转化原液取100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。2. 倒置平板于37继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3.

25、 不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有-半乳糖苷酶活性,在LB筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了-半乳糖苷酶活性,在LB选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。（四）、 酶切鉴定重组质粒 1. 用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50g/ml的 5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时。2. 使用快速分离质粒DNA直接电泳，同时以抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。3. 再用与连接未端相对应的限

26、制性内切酶进一步进行酶切检验。4. 还可用杂交法筛选重组质粒。5. PCR法 五、注意事项 1. DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2. 在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。3. 连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是在-20冰冻保存将会降低转化效率。4. 粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37，在连接粘性末端时，反应温度以10-16为好，平齐末端则以15-20为好

27、。5. 在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6. LB选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。7. X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。8. 在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显试验五 CTAB法提取植物基因组DNA这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB（十