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E俩个启动序列和数个编码基因
2．有关操纵子学说的论述，正确的是
A.操纵子调控系统是真核生物基因调控的主要方式
B.操纵子调控系统是原核生物基因调控的主要方式
C.操纵子调控系统由调节基因、操纵基因、启动子和结构基因组成
D.诱导物和阻遏蛋白结合启动转录
E.诱导物和启动子结合而启动转录
3．转录因子是
A.调节DNA结合活性的小分子代谢效应物B.调节转录延伸速度的蛋白质
C.调节转录起始速度的蛋白质D.调节转录产物分解速度的蛋白质
E.促进转录产物加工的蛋白质
4．阻遏蛋白（阻抑蛋白）识别操纵子中的
A.启动基因B.结构基因C.操纵基因D.内含子E.调节基因
5.在下列哪种情况下，乳糖操纵子的转录活性最高
A.高乳糖，低葡萄糖B.高乳糖，高葡萄糖C.低乳糖，低葡萄糖
D.低乳糖，高葡萄糖E.不壹定
6.顺式作用元件是指
A.基因的5ˊ侧翼序列B.基因的3ˊ侧翼序列C.基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列
D.基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列以外的序列E.具有转录调节功能的特异DNA序列
7.反式作用因子是指
A.具有激活功能的调节蛋白B.具有抑制功能的调节蛋白
C.对自身基因具有激活功能的调节蛋白D.对另壹基因具有激活功能的调节蛋白
E.对另壹基因有调节功能的蛋白质因子
8.下列关于限制性内切酶的叙述哪壹项是错误的
A.它能识别DNA特定的碱基顺序，且在特定的位点切断DNA
B.切割点附近的碱基顺序壹般呈回文结构
C.它能专壹性降解经甲基化修饰的DNA
D.是重组DNA的重要工具酶
E.主要从细菌中获得
9.基因工程中，不常用到的酶是
A.限制性核酸内切酶B.DNA聚合酶C.DNA解链酶D.DNA连接酶E.反转录酶
10下列哪项不能作为表达载体导入真核细胞的方法？
A.磷酸钙转染B.电穿孔C.脂质体转染D.氯化钙转染E.显微注射
11.重组体的筛选方法有
A.抗药标志筛选B.标记补救C.分子杂交D.免疫化学E.酶联免疫检测
12.cDNA是指
A.在体内合成的和病毒DNA或RNA互补的DNA
B.在体外经反转录合成的和DNA互补的DNA
C.在体外经转录合成的和DNA互补的RNA
D.在体外经反转录合成的和RNA互补的DNA
E.在体内经转录合成的和DNA互补的RNA
13．建cDNA文库时，首先需分离细胞的
A.染色体DNAB.线粒体DNAC.总mRNAD.tRNAE.rRNA
（四）判断题
1.高等真核生物的大部分DNA是不为蛋白质编码的。
2.大多数管家基因编码低丰度的mRNA.
3.乳糖能够诱导乳糖操纵子的表达，所以乳糖对乳糖操纵子的调控属于正调控系统。
4.某些蛋白质既能够作为阻遏蛋白又能够作为激活蛋白参和基因表达的调控。
5.准备用原核生物表达真核基因时，最好通过cDNA获取目的基因。
6.用原核生物表达真核生物的糖蛋白，其表达产物不会有正常的生物学功能。
7.Ti质粒能够随土壤农杆菌进入植物细胞。
8.用λ噬菌体作克隆载体时，外源DNA片断越小，克隆的成功率越高。
9.基因克隆选择的宿主细胞必须无限制性核酸内切酶。
10.采用蓝白斑选择法时，蓝色菌落或噬菌斑是含有重组载体的克隆。
（五）分析和计算题
1.简述操纵子的基本结构。
2.举例说明基因表达的诱导和阻遏，正调控和负调控。
3.概述原核生物基因表达调控的特点。
4.概述真核生物基因组的特点。
5.概述真核生物基因表达调控的特点。
6.简答真核生物基因表达的调控方式。
7.常用的限制性核酸内切酶有哪些特点？
8.在基因克隆中，目的基因有哪些主要来源？
9.什么是cDNA文库？
cDNA文库和基因组文库有何差别？
10.用于DNA重组的载体应具备什么条件？
常用的载体有哪壹些？
各有何特点？
11.简述连接目的基因和载体的主要方法？
12.概述筛选和鉴定DNA重组体的常用方法。
参考答案
1.原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在壹起，转录生成壹个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某壹代谢过程的酶，或共同完成某种功能。
这些结构基因和其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
顺式调控元件：
指可影响自身基因表达活性的真核DNA序列。
根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，分为启动子、增强子及沉默子等。
2.是RNA聚合酶结合位点周围的壹组转录控制组件，包括至少壹个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
3.是壹种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的壹段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。
增强子通常占100～200bp长度，也和启动子壹样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，能够单拷贝或多拷贝串连形式存在。
4.在原核生物的Trp操纵子结构中，第壹个结构基因和启动子P之间有壹个区域含Trp密码子，称衰减子。
当环境中Trp浓度很高时，它可通过编码且翻译，使正在转录的mRNA形成终止信号，从而终止Trp操纵子的表达。
这种转录衰减实质上是转录和壹个前导肽翻译过程的偶联，它是原核生物特有的壹种基因调控机制。
5.大多数真核转录调节因子由某壹基因表达后，通过和特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用），或通过和基它调节因子的相互作用（蛋白质-蛋白质相互作用），反式激活另壹基因的转录，故称反式作用蛋白或反式作用因子。
6.也就是cAMP受体蛋白（cAMPreceptorprotein,CRP），它和cAMP的复合物能够促进某些原核操纵子（如乳糖操纵子）的转录。
7.“克隆”作为名词指相同的分子或细胞构成的群体，或壹个共同的祖先通过无性繁殖所得到的群体，作为动词指获取“克隆”的过程。
克隆技术特指获取“克隆”的过程，包括分子克隆，细胞克隆等技术。
8.就是识别DNA的特异序列，且在识别位点或其周围切割双链DNA的壹类核酸内切酶。
限制性核酸内切酶存在于细菌体内，和相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制、修饰体系，限制外源DNA，保护自身DNA，对保持细菌遗传物质的稳定具有重要意义。
限制性核酸内切酶分为三类，其中的Ⅱ类酶能特异性在壹定的核苷酸序列处切割双链DNA，因而在基因工程中得到广泛的应用。
9.利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成壹定大小的片段，将这些片段分子和适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌，使每个细菌内都携带壹种重组DNA分子。
不同细菌中的重组DNA分子可能包含不同的染色体DNA片段，这样，只要得到的转化细菌所携带的重组DNA分子种类足够多，则全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。
存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称基因组DNA文库。
基因组DNA文库涵盖了基因组的全部基因信息。
10.以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，和适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有壹段cDNA，且能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有壹部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。
另外，对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因和从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接，去除了内含子的cDNA。
壹般来说，从cDNA文库获得的基因，因不含内含子而片段较小，更适合于用作基因工程的目的基因。
由于原核生物不存在将hnRNA加工成mRNA的酶系统，若用原核生物表达真核基因，则目的基因壹定要通过cDNA获取。
1．负调控，正调控；
2.启动子，启动，操纵；
3.管家基因，诱导，阻遏；
4.限制性核酸内切，DNA连接；
5.质粒，病毒；
6.腺病毒载体，反转录病载体，Ti质粒。
7.转化，转导；
8.DNA，RNA，蛋白质；
1.（B）操纵子均含有数个编码基因，但启动序列只有1个。
2.（B，C，D）操纵子调控系统由调节基因，操纵基因，启动子和多个结构基因组成，是原核生物基因表达调控的主要方式，诱导物和组遏蛋白结合启动转录。
诱导物不能直接和启动子结合。
真核生物不存在操纵子调控系统。
3.（C）转录因子是调节转录起始的蛋白质，对转录延伸的速度，转录产物分解的速度和转录产物的加工均无影响。
4.（C）操纵基因位于启动基因和结构基因之间，阻遏蛋白和操纵基因结合后，和启动基因结合的RNA聚合酶不能转录结构基因。
5.（A）参和乳糖代谢的三种酶的表达同时受控于正负调控俩种机制，只有在正调控发挥作用，负调控不起作用的时候，这三种酶才能有效的表达。
当培养基中加入乳糖的时候，参和负调控的阻遏蛋白将失去活性，但如果培养基中含有葡萄糖，则细菌优先利用葡萄糖，这时参和乳糖代谢的酶仍然不能有效的表达，这是因为葡萄糖降低了细胞内的cAMP水平，而cAMP浓度的降低，导致降解物激活蛋白丧失活性，正调控的机制失去作用，这时三种酶不可能正常的表达。
6.（E）顺式作用元件是对某基因自身有调节功能的DNA序列，其中的启动子多在基因的5ˊ侧翼，但增强子既能够在5ˊ侧翼，又能够在3ˊ侧翼，壹般距基因较远。
有些顺式作用元件甚至能够在基因内部。
7.（E）反式作用因子是指对另壹基因的表达有激活或抑制作用的蛋白质因子。
8.（C）限制性核酸内切酶主要存在于细菌，它能够水解外源DNA，而自身DNA因在特定位点被甲基化而能够免遭水解。
限制性核酸内切酶由于可识别特定的碱基序列且在特定的位点切割双链DNA，因而在基因工程中得到广泛的使用。
9.（C）DNA聚合酶可用来获取目的基因，测序和PCR等项工作，限制性核酸内切酶用于DNA酶切片段长度的多态性分析，载体和目的基因的特异性切割等工作，DNA连接酶可用于基因重组的连接反应。
DNA解链酶在基因工程中几乎用不到。
10.（D）CaCl2处理受体细胞是提高细菌转化率的常用方法，不适用于真核生物，题中列出的其余4种方法均可用于将表达载体导入真核细胞。
11.（A，B，C，D，E）题中列出的5种方法均可用于重组体的筛选。
12.（D）cDNA指在体外经反转录合成的和RNA互补的DNA。
13．（C）cDNA文库应包含某壹细胞在某壹状态下所表达的基因，因此，构建cDNA文库首先要分离细胞的总mRNA。
1.对。
高等真核生物的DNA中含有不少高度重复序列的非编码序列，基因内部又有内含子，不少基因内含子的总长度远远大于外显子。
因此，真核生物的编码区只占DNA总长度的壹小部分，壹般认为，编码区不超过总长度的5%。
2.对。
管家基因是持续表达的，mRNA丰度不高，但寿命较长，翻译效率较高。
3.错。
乳糖被转化为别乳糖后，和乳糖操纵子调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白失去活性。
由于这壹调控方式起作用的是阻遏蛋白，故属于负调控。
4.对。
某些蛋白质能够和DNA分子的不同区域结合，分别发挥激活蛋白或阻遏蛋白的作用。
5.对。
真核生物的基因多数含有内含子，原核生物缺乏从转录初级产物切除内含子的加工系统，另外，如果将基因组DNA作为目的基因，基因片段因含有内含子而过大，也会降低基因转移的成功率。
cDNA是以成熟mRNA为模板经过反转录制成的，不含内含子，适合于作为目的基因用于基因的克隆或表达。
6.对。
原核生物缺乏真核生物的翻译后加工系统。
不能对蛋白质进行糖基化。
因此，表达糖蛋白要用真核表达系统。
7.错。
土壤农杆菌能够促进Ti质粒进入植物细胞，但农杆菌本身且不进入植物细胞。
8.错。
λ噬菌体的外壳蛋白只能包装长度为噬菌体DNA78%～105%的DNA，若外源DNA片段太小，重组体DNA的长度小于噬菌体DNA的78%，就不能在体外包装成噬菌体，因而，克隆很难成功。
9.对。
如果宿主细胞有限制性核酸内切酶，将会水解进入宿主细胞的重组体DNA，导致克隆失败。
10.错。
采用蓝的斑选择法时，克隆位点被选在表达-肽的基因内，含有空载体的受体菌能够在IPTG（异丙基硫代--D-半乳糖苷）的诱导下，表达-肽，通过和受体菌的-互补，能够水解X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）生成蓝色的水解产物，因而菌落或噬菌斑为蓝色。
含有重组DNA的受体菌，由于外源基因插入表达-肽的基因内，不能表达-肽，因而，菌落或噬菌斑为白色。
1.操纵子的调控区有壹个操纵序列，壹个启动序列及壹个CAP位点，调控区下游有几个结构基因，仍有壹个调节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白和操纵序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
若cAMP和CAP结合，形成的复合物和CAP位点结合，可增大操纵子的转录活性。
阻遏蛋白的负性调节和CAP的正性调节共同调节结构基因的表达，操纵子机制在原核基因表达调控中具有较善遍的意义，因其多是几个功能相关基因串联于同壹操纵子上，故在同壹启动序列控制下，可转录出能为多种蛋白质编码的mRNA，即多顺反子mRNA。
2.在特定的环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，则这种基因是可诱导的。
可诱导基因在特定的环境中表达增强的过程称为诱导。
例如有DNA损伤时，修复酶基因就会在细菌内被诱导激活，使修复酶的活性增加。
相反，如果基因对环境信号应答时被抑制则这种基因是可阻遏的，可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏，例如，当培养液中色氨酸供应充分时，在细菌内编码色氨酸合成相关酶的基因表达会被抑制。
如果某种基因在没有调节蛋白存在时是表达的，加入某种调节蛋白后基因表达活性便被关闭，这样的控制为负调控。
例如，乳糖操纵子。
相反，若某种基因在没有调节蛋白存在时是关闭的，加入某种调节蛋白后基因活性就被开启，这种控制称为正调控。
例如代谢物阻遏。
3.原核基因表达调控和真核存在很多共同之处，但因原核生物没有细胞核和亚细胞结构，其基因组结构要比真核生物简单，基因表达的调控因此而比较简单。
虽然原核基因的表达也受转录起始、转录终止、翻译调控及RNA、蛋白质的稳定性等多级调控，但其表达开、关的关键机制主要发生在转录起始。
其特点包括以下3方面：
（1）σ因子决定RNA聚合酶的识别特异性：
原核生物只有壹种RNA聚合酶，核心酶催化转录的延长，亚基识别特异启动序列，即不同的因子协助启动不同基因的转录。
（2）操纵子模型的普遍性：
除个别基因外，原核生物绝大数基因按功能相关性成簇地连续排列在染色体上，共同组成壹个转录单位即操纵子，如乳糖操纵子等。
壹个操纵子含壹个启动序列及数个编码基因。
在同壹个启动序列控制下，转录出多顺反子mRNA。
（3）阻遏蛋白和阻遏机制的普遍性：
在很多原核操纵子系统，特异的阻遏蛋白是控制启动序列活性的重要因素。
当阻遏蛋白和操纵基因结合或解离时，结构基因的转录被阻遏或去阻遏。
4
（1）基因组结构庞大：
哺乳动物基因组DNA由约bp的核苷酸组成。
大约有3万个左右的基因，90%之上的DNA不为蛋白质编码。
真核细胞DNA和组蛋白结合形成复杂的染色质结构，基因表达调控机制更加复杂。
（2）单顺反子：
真核基因转录产物为单顺反子，即壹个编码基因转录生成壹个mRNA分子，经翻译生成壹条多肽链。
许多蛋白质由几条不同的多肽链组成，因此存在多个基因的协调表达。
（3）重复序列：
重复序列在真核DNA中普遍存在，重复序列长短不壹，短的在10个核苷酸以下，长的达数百，乃至上千个核苷酸。
据重复频率不同分为高度重复序列、中度重复序列及单拷贝序列。
（4）基因的不连续性：
结构基因的俩侧有不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。
在编码基因内部有壹些不为蛋白质编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称外显子，因此真核基因是不连续的。
5.同原核生物壹样，真核基因表达调控的最基本环节也是转录起始，而且某些机制是相同的，但也存在明显差别：
（1）RNA聚合酶：
真核有3种RNA聚合酶，分别负责3种RNA转录。
（2）活性染色质结构变化：
当基因被激活时，可观察到染色体相应区域发生结构和性质变化。
包括对核酸酶敏感，DNA拓扑结构变化，DNA碱基修饰变化和组蛋白变化。
（3）正调节占主导地位：
真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质性的亲和力，二者的结合必须依赖壹种或多种激活蛋白。
尽管发现少量基因存在负性顺式作用元件，但普遍存在的是正性调节机制。
（4）转录和翻译分隔进行：
真核细胞有胞核及胞质等区间分布，转录和翻译在不同亚细胞结构中进行。
（5）转录后加工：
真核基因的内含子和外显子均被转录，内含子在转录后要被剪接去除，使外显子连接在壹起，形成成熟的mRNA。
不同剪接方式可形成不同的mRNA，翻译出不同的多肽链。
因此，转录后加工是真核基因表达调控的另壹重要环节。
6.
（1）DNA水平的调控：
a.基因丢失，即DNA片段或部分染色体的丢失，如蛔虫胚胎发育过程有27%的DNA丢失。
b.基因扩增，即特定基因在特定阶段的选择性扩增，如非洲爪蟾卵母细胞中的rDNA是体细胞的4000倍。
c.DNA序列的重排，如哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接。
d.染色质结构的变化，通过异染色质关闭某些基因的表达。
e.DNA的修饰，如DNA的甲基化关闭某些基因的活性。
（2）转录水平的调控。
a.染色质的活化，如核小体结构的解开、非组蛋白的作用等。
b.转录因子的作用，转录因子和RNA聚合酶及特定的DNA序列（启动子、增强子）相互作用实现对转录的调控。
（3）转录后水平的调控。
a.mRNA前体的加工，如5′端加帽、3′端加尾、拼接、修饰、编辑等。
B.mRNA的选择性拼接，如抗体基因的选择性拼接。
（4）翻译水平的调控。
a.控制mRNA的稳定性，如5′端的帽子结构、3′端polyA尾巴和mRNA和蛋白质的结合有利于mRNA的稳定。
b.反义RNA的作用，反义RNA能够选择性抑制某些基因的表达。
c.选择性翻译，如血红素缺乏时，通过级联反应使eIF2磷酸化。
d.抑制翻译的起始。
（5）翻译后水平的调控。
a.多肽链的加工和折叠，如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、蛋白质的降解。
b.氨基酸的重排，如合成伴刀豆蛋白A时，氨基酸序列大幅度地被剪接重排。
c.通过肽链的断裂等的加工方式产生不同的活性多肽。
7.Ⅱ型限制性核酸内切酶（限制酶）是基因工程中常用的重要工具酶，是壹类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的核酸内切酶，常用的限制酶主要有以下特点：
（1）均来自于微生物，且以其来源的微生物学名进行命名；
（2）相对分子质量小，仅需Mg2+作为辅助因子，无需ATP；
（3）识别特异性DNA双链顺序，在序列内特异切割产生特异性DNA片段；
（4）识别序列长度为连续的4/6/8bp；
（5）识别序列呈二重旋转对称，称回文结构，富含GC；
（6）有3种切口：
5′端突出的黏性末端（如HindⅢ），3′端突出的黏性末端（如PstⅠ）和平末端（如H加工）。
8.
（1）从染色体DNA中直接分离：
主要针对原核生物。
（2）化学合成法：
由已知多肽的氨基酸序列，推得编码这些氨基酸的核苷酸序列，利用DNA合成仪人工合成其基因。
（3）从基因组DNA文库中筛选分离组织/细胞染色体DNA：
利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成片段，和适当的克隆载体连接后转入受体菌扩增，即获得基因组DNA文库，用核酸探针将所需目的基因从基因文库中“钓”取出来。
（4）从文库中筛选cDNA：
提取mRNA，利用反转录酶合成和其互补的DNA（cDNA）分子，再复制成双链cDNA片段，和适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库，然后采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。
（5）用PCR从基因组DNA或cDNA中扩增目的基因。
9.同mRNA互补的DNA称为cDNA。
cDNA文库是以某壹细胞的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成互补DNA的第壹链，破坏RNA模板后，再以第壹链为模板合成第二链，得到双链cDNA。
选用适合的载体，和合成的cDNA重组，导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。
由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的壹种通用方法。
由于细胞内的基因在表达的时间上且非是统壹的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。
所以，cDNA文库不可能构建得十分完全，也就是说任何壹个cDNA文库都不可能包含某壹生物的全部编码基因。
cDNA文库和基因组文库的主要差别是：
（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。
（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cDNA文库克隆的是被转录DNA序列（因它受发育和调控因子的影响）。
（3）基因组文库中的编码基因是含有内含子和外显子，而cDNA克隆的基因不含内含子。
10.DNA重组载体应具备的条件：
（1）能自主复制；
（2）具有壹种或多种限制性内切酶的单壹切割位点，且在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；
（3）具有1～2个筛选标记；
（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且且不会任意转入其他生物细胞；
（5）易于操作，转化效率高。
常用的基因载体有以下几种：
（1）质粒：
是细菌染色体以外的小型环状双链DNA分子，本身有复制功能，且带有某些选择信息，但可插入的目的基因片段较小。
（2）噬菌体DNA：
是壹种病毒DNA，能插入比较大的外源DNA片段，在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆。
（4）柯斯质粒载体和酵母人工染色体：
前者结合了质粒和噬菌体载体的优点，也是壹种环形双链DNA分子，具有质粒的性质，能够转化大肠杆菌，且自行复制和增殖，但它不会产生子代噬菌体，构建成的此种载体较小，因此能插入比较大的外源DNA片段，所以被广泛地用于构建基因组文库。
后者既含有大肠杆菌来源的质粒复制起始位点，又含有酵母菌染色体DNA
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