食品微生物检验学实验指导 0308.docx

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食品微生物检验学实验指导0308

食

品

微

生

物

检

验

学

实

验

指

导

2013-3-19

实验1菌落总数测定

主要内容：

1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。

实验2大肠菌群MPN测定

主要内容：

1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。

实验3大肠杆菌检验

主要内容：

1）样品前处理；2）增菌（肠道增菌液）；3）分离（麦康凯或伊红美蓝琼脂）；4）革兰氏染色、镜检；5）生化试验（TSI，pH7.2尿素，甲基红试验和吲哚试验，V-P试验和枸橼酸盐试验）

实验4金黄色葡萄球菌检验

主要内容：

1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。

4）报告。

实验5魏氏梭菌检验

主要内容：

1）细菌筛选（亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶，SPS琼脂）；2细菌培养（液体硫乙醇酸盐培养基，FT培养基）；3）动力硝酸盐还原实验；4）暴烈发酵实验；5）卵黄脂酶水解实验。

实验6罐头食品检验

主要内容：

1）罐头感观检查；2）pH值测定；3）染色镜检；4）接种培养（庖肉培养，溴甲酚紫葡萄糖肉糖，麦芽浸膏汤）5）平板筛选（锰盐营养琼脂平板，血琼脂平板，卵黄琼脂平板）

实验7PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

主要内容：

1）以鼠伤寒沙门氏菌以SdiA为模板设计引物：

（PCR产物长度：

562bp

FsdiA:

5′-tggcagcagaggatgtttat-3′

RsdiA5′-tcgatctccgatgaggtctt-3′

2）细菌单克隆水悬浮后做模板，做PCR

3）电泳检测是否扩出条带。

实验8霉菌检验

主要内容：

1）样品稀释2）平板接种培养（马铃薯－葡萄糖琼脂，孟加拉红琼脂）；3）菌落计数

实习周:

鸡蛋中沙门氏菌筛选、分离、生化鉴定及嗜菌体检测

主要内容：

（一）样品前处理及增菌培养；

（二）沙门氏菌在选择平板上菌落特征观察；（三）沙门氏菌染色特性和生化特性观察；（四）沙门氏菌噬菌体鉴定。

实验一菌落总数测定

[目的与要求]

1.通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。

2.菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。

[实验器材及试剂]

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、稀释液、营养琼脂、牛奶等。

[实验内容]

（一）检样稀释及培养：

1.以无菌操作，将检样（牛奶）0.5ml放于含有4.5mL灭菌生理盐水试管内，经充分振摇或研磨作成1：

10的均匀稀释液。

2.用无菌移液器吸取1：

10稀释液0.5ml，注入含有4.5mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：

100倍稀释。

3.更换枪头后，再用无菌移液器，按

（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL无菌枪头。

4.根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用移液器吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。

5.稀释液移入平皿后，应立即将冷至46℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15-20ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lml灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。

6.待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养48±2h。

（二）菌落计数

1选取30-300CFU之间，无蔓延生长的、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

（三）结果与报告

1菌落总数的计算方法

1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式

（1）计算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d

（1）

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

示例：

稀释度

1:

100（第一稀释度）

1:

1000（第二稀释度

菌落数（CFU）

232，244

33，35

N=∑C/（n1+0.1n2）d

=（232+244+33+35）/[2+（0.1×2）]×10-2

=544/0.022

=24727

上述数据按2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。

1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2菌落总数的报告

2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

[思考题]

1菌落总数的食品卫生学意义？

2影响本实验结果的因素有哪些？

实验二大肠菌群数的测定

[目的与要求]

1．掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。

2．了解大肠菌群的食品卫生学意义

[原理]

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。

[实验器材及试剂]

样品：

牛乳

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水等。

[实验内容]

一、常规检验法

1检样稀释及培养

取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成10倍递减的均匀系列稀释液，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

2初发酵实验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。

产气者，计为大肠菌群阳性管。

4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

[思考题] 

1为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？

2 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？

表3-2　大肠菌群最可能数（MPN）检索表

阳　性　管　数

MPN

100ml（g）

95％可信限

1ml（g）×3

0.1ml（g）×3

0.01ml（g）×3

下限

上限

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

2

3

＜30

30

60

90

　＜5

　90

0

0

0

0

1

1

1

1

0

1

2

3

30

60

90

120

＜5

130

0

0

0

0

2

2

2

2

0

1

2

3

60

90

120

160

＜5

　200

0

0

0

0

3

3

3

3

0

1

2

3

90

130

160

190

10

210

1

1

1

1

0

0

0

0

0

1

2

3

40

70

110

150

10

230

1　

1

1

1

1

1

1

1

0

1

2

3

70

110

150

190

30

360

1

1

1

1

2

2

2

2

0

1

2

3

110

150

200

240

30

360

1

1

1

1

3

3

3

3

0

1

2

3

160

200

240

290

30

360

2

2

2

2

0

0

0

0

0

1

2

3

90

140

200

260

10

370

2

2

2

2

1

1

1

1

0

1

2

3

150

200

270

340

30

440

2

2

2

2

2

2

2

2

0

1

2

3

210

280

350

420

70

70

390

470

2

2

2

2

3

3

3

3

0

1

2

3

290

360

440

530

100

1500

3

3

3

3

0

0

0

0

0

1

2

3

230

390

640

950

40

70

150

1200

1300

1800

3

3

3

3

1

1

1

1

0

1

2

3

430

750

1200

1600

70

140

300

2100

2300

3800

3

3

3

3

2

2

2

2

0

1

2

3

930

1500